スズムシソウ類（ラン科）における発芽時の菌根共生系の遺伝的制御の解明

Research Project

Project/Area Number	22K06364
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 45030:Biodiversity and systematics-related
Research Institution	National Museum of Nature and Science, Tokyo
Principal Investigator	堤千絵独立行政法人国立科学博物館, 植物研究部, 研究主幹 (30455422)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小木曽映里独立行政法人国立科学博物館, 分子生物多様性研究資料センター, 特定非常勤研究員 (00646929) 片山なつ千葉大学, 大学院理学研究院, 日本学術振興会特別研究員(RPD) (20723638)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	菌根共生 / ラン科植物 / 初期発生
Outline of Research at the Start	ラン科植物における種子発芽時の菌根共生系がどのような遺伝的制御によって成立しているのかを明らかにするため、スズムシソウなどを用いて、発生が正常に進む本来の菌、ならびに途中で発生が停止する非適合な菌と共生培養を行い、さまざまな発生段階にてトランスクリプトーム解析を行い、菌根共生の成立過程で働く遺伝子群と、発生が停止する段階で働く遺伝子群を、植物と菌それぞれで明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	ラン科スズムシソウ類は、適切な菌とでは正常に発生するが、非適合な菌とでは発芽しない、あるいは途中で停止する。スズムシソウやジガバチソウ、クモキリソウを用いて、発生が正常に進む本来の菌、ならびに途中で発生が停止する非適合な菌と共生培養を行い、さまざまな発生段階にてトランスクリプトーム解析を行い、菌根共生の成立過程で働く遺伝子群と、発生が停止する段階で働く遺伝子群を、植物と菌それぞれで調査し、種子発芽時の菌根共生系がどのような遺伝的制御によって成立しているのかを明らかにする。合わせて菌の全ゲノム解析を行い、菌種によって植物側の応答が異なる背景にはどのようなゲノムの差異があるかを調査する。これまでにスズムシソウ共生菌、シマクモキリソウ由来の菌、クモキリソウ由来の菌それぞれと共生培養したスズムシソウ胚からRNAを抽出し、RNA-Seq解析を行った。データをアセンブルして得られた発現遺伝子数はおよそ14万で、blast等により菌と植物とに分けた結果、菌と推定される遺伝子数は約6.7万、ランは3万弱であった。共生菌の違いによる遺伝子の発現変動パターンにより、発現遺伝子のクラスター分けを行ったところ、シマクモキリソウ由来菌とスズムシソウ由来菌との共生培養胚で発現上昇する遺伝子群と、スズムシソウ由来菌との共生培養胚でのみ発現上昇する遺伝子群が特定され、GO enrichment解析により各共生成立段階において重要と期待される遺伝子群を絞り込んだ。さらに、クモキリソウ由来の菌について、HiSeqXならびにMinIONを用いて全ゲノム解析を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason おおむね順調に解析が進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	さまざまなステージでのトランスクリプトーム解析において、まだ解析できていない一部のサンプルや、ランと菌それぞれ単体でのリファレンス作成を行う。さらに、菌側の発現変動解析、共生阻害で作用する遺伝子の解析を行う。重要な遺伝子が検出されれば、植物あるいは菌のどのステージで発現しているかをRT-qPCRにより確かめる。菌根共生の発生過程の形態学的調査では、ジガバチソウならびにクモキリソウでは、一部の菌種との詳細な発生過程の解析が不十分である。そのため両種と複数の菌種と共生培養を行い、経時的にサンプルを収集して、準超薄切片を作成し、植物の発生と細胞内における菌根菌の動態を観察する。菌の全ゲノム解析では、まだ解析できていないスズムシソウ由来の菌、シマクモキリソウ由来の菌について、すでに解析したクモキリソウ由来の菌をもとにアセンブリや遺伝子構造の予測を行い、それぞれのゲノムの差異を明らかにする。