過剰な遠隔恐怖記憶の形成に関わる脳内機構の解明

Research Project

Project/Area Number	22K06444
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	井上蘭富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (70401817)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	遠隔恐怖記憶 / 扁桃体 / 記憶痕跡細胞 / グルココルチコイド受容体
Outline of Research at the Start	過剰な遠隔恐怖記憶がPTSDの病態形成に深く関わると考えられているが、脳内でどのような細胞、神経回路レベルの変化が過剰な遠隔恐怖記憶の基盤となっているかは不明である。本研究では過剰な遠隔恐怖記憶が認められた扁桃体外側核選択的グルココルチコイド受容体ノックアウト（LAGRKO）マウス用いて、遠隔恐怖記憶の形成に関わる脳部位である内側前頭前皮質(mPFC)並びに聴覚皮質(AC)に出現する記憶痕跡細胞がLAGRKOマウスでどのように変化し、これらの変化と過剰な遠隔恐怖記憶との因果関係を明らかにすることでPTSDの病態解明を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	トラウマ体験時の音や匂いなどの感覚刺激は恐怖と結びつきやすく、後に恐怖反応を惹起する手がかりとなる。このような手がかり依存性の記憶が一ヶ月以上持続するものは遠隔記憶と呼ばれ、過剰な遠隔恐怖記憶は心的外傷後ストレス障害（PTSD）の病態形成に深く関わると考えられている。しかしながら、PTSDの原因となる過剰な遠隔恐怖記憶を引き起こす脳内機構はほとんど不明である。これまで我々はグルココルチコイド受容体(GR)を扁桃体外側核（LA）選択的に欠損させたマウス(LAGRKO)において、音依存的恐怖条件付け28日後の遠隔恐怖記憶がコントロールマウス(Floxed GR)に比べ有意に増強されることを見出した。また、Floxed GRマウスに比べLAGRKOマウスでは遠隔恐怖記憶の想起を担う記憶痕跡細胞が恐怖条件付け時に内側前頭前野（mPFC）で有意に多く形成され、逆に聴覚皮質（AC）では少なく形成されることを明らかにした。今年度では、LAGRKO マウスで認められた記憶痕跡細胞の変化と過剰な遠隔恐怖記憶との因果関係を明らかにするため、記憶痕跡細胞の活動抑制を可能とするアデノ随伴ウィルスAAV-c-fos-rtTAとAAV-TRE-hM4D-mcherryをLAGRKOマウスとFloxed GRマウスのmPFCあるいはACに注入し、2カ月後に音依存的恐怖条件付け解析を行った。その結果、LAGRKO マウスのACにおける記憶痕跡細胞の神経活動を抑制すると遠隔恐怖記憶が増強し、逆にmPFCにおける記憶痕跡細胞の神経活動を抑制すると遠隔恐怖記憶が低下した。一方、Floxed GRマウスでは、記憶痕跡細胞の神経活動を抑制しても遠隔恐怖記憶に影響を与えなかった。これらの結果から、ACとmPFCにおける記憶痕跡細胞の変化が過剰な遠隔恐怖記憶の原因の一つであることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason LAGRKOマウスで認められた過剰な遠隔恐怖記憶の形成にmPFCならびにACの記憶痕跡細胞の変化がどのように関与するかを明らかにするため、薬理遺伝学的手法と行動解析を併用し、実験を行った。その結果、LAGRKO マウスのACにおける記憶痕跡細胞の神経活動を抑制すると遠隔恐怖記憶が増強し、逆にmPFCにおける記憶痕跡細胞の神経活動を抑制すると遠隔恐怖記憶が低下することを見出した。一方、Floxed GRマウスでは、記憶痕跡細胞の神経活動を抑制しても遠隔恐怖記憶に影響を与えなかった。これらの結果から、ACならびにmPFCを中心とした神経回路の異常が過剰な恐怖記憶を引き起こす原因であることが明らかとなった。よって、予定とおり研究は進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	上記のように、過剰な遠隔恐怖記憶の形成過程においてmPFCとACは相互的に機能を抑制する可能性が考えられる。さらにAAV-GFPをmPFCあるいはACに注入しそれぞれの投射先を検討したところ、mPFCとACは相互的に神経連絡があることが観察された。そこで本年度では、mPFCとLAの記憶痕跡細胞間で作られるシナプスをdual-eGRASP手法を用いて可視化し、これらのシナプスが抑制性あるいは興奮性であるかを検討する。具体的にはAAVベクターを用いて、mPFCにpre-eGRASPを発現させ、ACにpost-eGRASPを発現させる。また、神経活動依存的に発現が誘導される初期応答遺伝子c-fosのプロモーターと、doxcycline投与で発現誘導の時期を制御できるTet-onシステムを組み合わせることで、恐怖条件時に活性化される記憶痕跡細胞のみにeGRASPを発現させる。恐怖条件付け28日後の遠隔記憶テスト後、LAGRKOマウスとFloxed GRマウスの脳を摘出し、抑制性シナプスマーカーであるgephyrinと興奮性シナプスマーカーであるVGluT1の免疫蛍光染色を行い、蛍光標識されるmPFC-AC間のシナプスが抑制性あるいは興奮性であるかを検討する。