| Project/Area Number |
22K06450
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
藤島 和人 大阪医科薬科大学, 医学部, 助教 (20525852)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 樹状突起 / スペクトリン / 膜骨格 / プルキンエ細胞 / ニューロン / 形態形成 |
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| Outline of Research at the Start |
スペクトリンは細胞の力学的な安定性を担う膜骨格分子として知られる。神経突起ではアクチンと協調して反復性のはしご状構造を形成し突起を保護する。強固な膜骨格構造は発生期ニューロンの突起の持続的な進展を阻害する。進展を可能にするためには膜骨格を一時的かつ局所的に破壊・再生する神経特有の膜骨格リモデリング機構が必要である。本研究では培養ニューロンのイメージング解析によって膜骨格リモデリングの分子メカニズムを明らかにし、神経突起の保護と成長を両立する仕組みの一端を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経突起を力学的なストレスから保護するため突起膜直下に存在する膜骨格が抵抗力を生み出し、引き延ばされるのを制限する仕組みが必要だと考えられる。スペクトリン-アクチン膜骨格は樹状突起の膜直下で網目状構造を形成している。この網目が非筋型ミオシンと相互作用し、収縮することで強力に樹状突起を保護する可能性が考えられた。
本年度はまずスペクトリンと非筋型ミオシンIIの樹状突起内における局在を確認した。両分子は近接する位置に局在するものの明確な共局在は示さなかった。協調して働きうるかを調べるため、活性化状態のミオシンがスペクトリンと局在するか確認した。ミオシンを薬理的に活性化したところ、ミオシンは細胞膜直下に移行し、スペクトリンを巻き込みながら収縮しさらに樹状突起の退縮を引き起こすことが明らかになった。この時スペクトリンとミオシンは高い共局在を示した。一方でスペクトリンの発現阻害を行った条件下でミオシンを活性化させるとミオシンの収縮パターンにも変化が見られ、樹状突起の退縮も弱まる傾向にあった。スペクトリンがアクトミオシンの収縮に寄与していることを裏付ける。
一方で過度なストレスがかかったときに、一時的に膜骨格を破壊してストレスを開放することが神経突起の維持に必要な可能性が考えられる。スペクトリンはカルパインやカスパーゼに切断されるドメインを有する。膜骨格に引き延ばしストレスが生じた場合にスペクトリンの切断が引き起こされるか確認するための予備実験を行った。ストレッチチャンバー上で細胞を培養し、基質の引き延ばしを行い、人為的に膜骨格に引き延ばしストレスを付加する。内在性または強制発現したスペクトリンの切断が生じるか確認しているが、現在のところ明確な結論は得ていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度に初代培養の立ち上げに時間を使ったため、やや研究の進行が遅れている。前年度立てた計画では神経活動が膜骨格のダイナミクスに与える影響を解析することを予定していたが、先に行ったスペクトリン分子とアクトミオシンで協調的な働きが見られるなど、研究に進展が見られた。そのためこちらに注力し計画を立て直した。本年度の研究でスペクトリン膜骨格の存在がアクトミオシンによる効率的な力形成に必要であることが示唆された。次年度では細胞の培養基質を引き延ばした際にスペクトリンがどう変化するかを解析して、外的な力への応答メカニズムを明らかにしたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究によりアクトミオシンがスペクトリンを含む膜骨格を収縮すること、スペクトリンを発現阻害するとアクトミオシンの収縮パターンが変化し膜から乖離することを示唆する結果を得た。これはスペクトリン膜骨格とアクトミオシンが協調して樹状突起の力産生に関わることを示す。次年度は引き続き、樹状突起の成長や保護に関わる膜骨格分子のリモデリング機構の解析を行う。
膜骨格による力産生は、神経突起が組織の成長などから生じる力学的ストレスへ対抗しうる。神経突起が受ける引っ張り刺激に対して、膜骨格が主体となり引っ張り返すことで細胞が破損から身を守る仕組みがある可能性がある。張力依存的にアクトミオシンの活性が上がり膜骨格を収縮させるかなどを確認する。またその分子的なメカニズムを追求する。
過度な力学的なストレスが神経突起に生じた場合、神経突起を保護するため、一時的に膜骨格を切断するなどして、ストレスを開放する仕組みがある可能性がある。これを確認するためにストレッチチャンバーを用いて細胞に引っ張り刺激を与える実験を引き続き行う。引っ張り強度が限度値を越えた際に、膜骨格の切断が生じるか確かめる。予備実験で株化細胞に進展ストレスを与えた結果では、野生型のスペクトリン分子の切断は確認できていない。進展強度やスピードを再検討する。また疾患に関連するスペクトリン分子を導入することで、力依存的な変異により変動するか確かめる。
膜骨格のストレスリリースが神経活動に依存している可能性もある。神経活動依存的なアクチンフィラメントの切断やスペクトリン分子の切断が生じるか調べる。
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