| Project/Area Number |
22K06457
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 46020:Anatomy and histopathology of nervous system-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
金子 涼輔 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 准教授 (40390695)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 神経回路形成 / 小脳 / プロトカドヘリン / 遺伝子改変マウス / 脊髄小脳変性症 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。
a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発
b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析
c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は申請者らの発見した「プルキンエ細胞個性」を足がかりとして、「登上線維が如何にして結合するプルキンエ細胞を選択するか？」に答える。
個々のプルキンエ細胞に結合する登上線維は1本のみである。この特異的結合はシナプス刈り込みを経て形成されるが、結合パートナーの選択メカニズムには不明な点が多い。申請者らは、クラスター型プロトカドヘリン(cPcdhα、β、γ。58種の多様化した細胞接着分子群)の、個々のプルキンエ細胞ごとに異なる組み合わせ発現を発見した。すなわち、個々のプルキンエ細胞にはcPcdh発現パターンの違いが作る「個性」がある。本研究では、このプルキンエ細胞個性の役割解明を目的として、プルキンエ細胞とそれに結合する登上線維におけるcPcdh発現パターンを明らかにする。
今年度は、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答えるための準備段階として、計画している課題a, b, cのうちの課題a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発に成功した。具体的には58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhα2）を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスである。昨年度までに完成していた14種類のcPcdha遺伝子の発現細胞にてtdTomatoとCreER(薬剤誘導型Cre-loxP組換え酵素)に対してゲノム編集を行い、cPcdhα2発現細胞のみがtdTomatoとCreERを発現するよう改変した。本マウスの脳を観察したところ、内在性cPcdhα2発現と同様のtdTomatoパターンが見られた。本マウスは特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作可能な世界初のマウスである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析。
現在までに、本研究遂行の上で必須となる、課題aが順調に進展している。具体的には、58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhb3）を発現する細胞を可視化可能なマウスの作製に成功している。さらに、cPcdhα2を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスの作製に成功した。
さらに、当初の予定よりも早くに課題bおよび課題cを進めている。課題bでは、プルキンエ細胞ならびに下オリーブ核におけるcPcdha2発現を、上記課題aにて作製したマウスにて可視化可能なことを見出した。また、課題cで用いる実験手法の実験技術を向上している。具体的には、登上線維を蛍光標識できる実験条件を見出した。すなわち、Cre依存的に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いる。このウイルスベクターを下オリーブ核へ投与する手法（針の長さ、挿入角度、挿入深さ）を精査し、安定して下オリーブ核へ投与できる条件を見出した。
以上のように、当初の計画から前倒しで予定していた３課題全てを実施しており、いずれについても期待通りの結果が得られているため、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本研究で計画している３課題、a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析のうち、課題aに特に注力して進める。具体的には、2023年度に得られたcPcdha2発現細胞の可視化と遺伝子発現操作が可能なマウスの交配、サンプリング、脳切片観察を行い、本マウスでのtdTomatoおよびCreER発現が内在性のcPcdha2発現を反映しているかを明らかにする。目的を満たすマウスが得られ次第、課題b、課題cを実施する。
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