| Project/Area Number |
22K06457
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 46020:Anatomy and histopathology of nervous system-related
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| Research Institution | Nara Medical University (2024)
Osaka University (2022-2023) |
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Principal Investigator |
金子 涼輔 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (40390695)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 神経回路形成 / 小脳 / プロトカドヘリン / 遺伝子改変マウス / 脊髄小脳変性症 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。
a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発
b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析
c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は申請者らの発見した「プルキンエ細胞個性」を足がかりとして、「登上線維が如何にして結合するプルキンエ細胞を選択するか？」に答える。
個々のプルキンエ細胞に結合する登上線維は1本のみである。この特異的結合はシナプス刈り込みを経て形成されるが、結合パートナーの選択メカニズムには不明な点が多い。申請者らは、クラスター型プロトカドヘリン(cPcdhα、β、γ。58種の多様化した細胞接着分子群)の、個々のプルキンエ細胞ごとに異なる組み合わせ発現を発見した。すなわち、個々のプルキンエ細胞にはcPcdh発現パターンの違いが作る「個性」がある。本研究では、このプルキンエ細胞個性の役割解明を目的として、プルキンエ細胞とそれに結合する登上線維におけるcPcdh発現パターンを明らかにする。
今年度は、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答えるための準備段階を行う予定であったが、代表者が研究機関を異動したため年度前半はその対応を行なった。年度後半は計画している課題a, b, cのうちの課題b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析を行なった。具体的には、昨年度までに完成したα2dRCマウス（cPcdhα2発現細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウス）を用いて脳におけるcPcdhα2発現動態を解析した。その結果、プルキンエ細胞と下オリーブ核に限らず脳の大部分の領域において、散発的かつ確率的なtdTomatoパターンが見られた。これは内在性cPcdhα2発現と同様であり、本マウスでの解析の有用性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析。
現在までに、本研究遂行の上で必須となる、課題aが順調に進展している。具体的には、58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhb3）を発現する細胞を可視化可能なマウスの作製に成功している。さらに、cPcdhα2を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスの作製に成功した。
さらに、課題bおよび課題cも順調に進んでいる。課題bでは、上記課題aにて作製したマウスを用いて、プルキンエ細胞ならびに下オリーブ核におけるcPcdha2発現およびcPcdhb3発現が散発的かつ確率的であることを明らかにした。また課題cでは、登上線維を蛍光標識できる実験条件を見出した。すなわち、Cre依存的に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いる。このウイルスベクターを下オリーブ核へ投与する手法（針の長さ、挿入角度、挿入深さ）を精査し、安定して下オリーブ核へ投与できる条件を見出した。
一方、2024年度に代表者が研究機関を異動したため、2024年度前半はその対応を行った。2024年度後半からは研究環境を構築しつつ、予定していた研究を進めた。2023年度までは、当初の計画から前倒しで進んでいたため、異動に伴う遅延を相殺でき、概ね予定通りとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本研究で計画している３課題、a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析のうち、課題cに特に注力して進め、本研究課題の核となる問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には、2023年度に得られたα2dRCマウスの下オリーブ核にCre依存的に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを投与し、脳を組織学的手法を用いて観察する。これによりプルキンエ細胞とそこに投射する登上線維におけるcPcdh発現を解析する。
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