光学的膜電位プローブとランダムスキャン2光子顕微鏡による局所神経回路読み出し

Research Project

Project/Area Number	22K06477
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 46030:Function of nervous system-related
Research Institution	Waseda University
Principal Investigator	井上貴文早稲田大学, 理工学術院, 教授 (10262081)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	光学的膜電位計測 / 2光子顕微鏡 / 小脳顆粒細胞 / 膜電位イメージング / タンパク質型膜電位センサー / 光学的膜電位記録 / 活動電位
Outline of Research at the Start	脳の局所神経回路が具体的にどの様なシナプス結合で機能的に結ばれているかという詳細な知見は脳の理解の大前提であるが、わかっていないことが多い。Caイメージングでは発火タイミングの前後関係や高頻度発火に追従できない。膜電位イメージングのプローブと測定系両者の進歩によって遂に局所神経回路の詳細な機能的情報読み出しが可能になった。本研究は申請者が開発したランダムアクセス２光子顕微鏡を用い、脳スライスおよびin vivo脳標本を対象に、これまで手つかずだった脳内の局所神経回路の詳細を明らかにする。小脳皮質の局所回路をターゲットにして顆粒細胞相互の同期性および顆粒細胞とプルキンエ細胞の同期性を解析する。
Outline of Annual Research Achievements	電位依存性センサーを用いた膜電位イメージングは局所神経回路の機能的結合の解析に適するが技術的なハードルがあった。音響光学偏光器(AOD)によるXYスキャンを採用し高速に多点を計測できるランダムスキャン型2光子顕微鏡を開発し複数培養神経細胞からの同時多点活動電位計測に成功し、さらに脳スライスを用いて新世代タンパク質型膜電位センサー（GEVI)を用い大脳皮質の発達にともなう神経結合の変化を見出した実績をベースとして、本年度は昨年度に引き続き脳の局所神経回路の理解を進めることを目的とし、小脳切片における複数顆粒細胞からの同時膜電位記録を試みてきた。GEVIは申請時のASAP3から派生した、より高感度が期待されるGEDI-2Pおよび未発表のGEVIを開発者から入手し、脳の神経細胞に発現させ脳切片標本で観察するための条件検討を続けている。本研究の対象である小脳顆粒細胞とプルキンエ細胞にGEVIを発現させるため、新生児脳内へDNAを注入してのエレクトロポレーション法を研究室で稼働させた。更にアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた発現方法を研究室で稼働させ、ウイルスの作成から感染までを行う系を立ち上げ、対象細胞での発現および電位計測を開始した。両者を比較検討した結果、ウイルス作成の手間を含めてもAAV使用が発現対象細胞の選択の広さや発現量等に軍配があがり、現在は発現手法をAAVにしぼりつつある。また、計画当初は掲げていなかった抑制性介在ニューロンにもカルシウム指示蛍光タンパク質あるいはGEVIの発現が可能となり、プルキンエ細胞と顆粒細胞に加えて介在ニューロンの活動も同時に観測する系を構築しつつある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason GEVIの飛躍的進歩により、新規高性能GEVIが利用可能になり、化合物プローブの使用は断念し、GEVIの利用切り替えた。大脳皮質ニューロンにGEVIを発現させた研究では子宮内電気穿孔法によりDNAを胎児脳に発現させたが、本研究での小脳顆粒細胞への発現では新生児脳でのエレクトロポレーション法の有効性を確認し、さらにアデノ随伴ウイルス(AAV)による発現系も並行して立ち上げ、両者を比較検討した。その結果、ウイルス作成の手間を含めてもAAVを使用した系が有効であることを確認し、現在はほぼAAVによる発現系を用いており、実際にGEVIをAAVにより小脳顆粒細胞・プルキンエ細胞および抑制性神経細胞に発現させる手法を確立しつつあり、実際に発現した個体については脳切片を作成しAOD2光子顕微鏡による膜電位計測を開始している。さらに脳切片のみならず生体マウス小脳からの直接計測（in vivo計測）の検討を開始している。
Strategy for Future Research Activity	小脳皮質の局所回路をターゲットにして顆粒細胞相互の同期性および顆粒細胞とプルキンエ細胞の同期性の解析を行う。本研究のターゲットである小脳皮質は、高密度に存在する顆粒細胞からプルキンエ細胞への大規模なシナプス結合の収斂や、プルキンエ細胞からの出力の並列性など非常に特徴的な回路構造を持ち、小脳皮質の情報処理特性を構造そのものが現していると考えられてきた。しかしながらプルキンエ細胞においては、隣り合うプルキンエ細胞同士には化学・電気シナプス結合ではなく電流漏れによる膜電位干渉があり、発火の同期性を作り出していることがやっと近年になって報告され、顆粒細胞は、その小ささ故にパッチクランプ記録自体の難易度が高く、顆粒細胞相互の同期性の知見はほとんどなく、顆粒細胞相互の発火同期がゴルジ神経細胞間の電気的カップリングによっている、という理論神経科学の20年前の予想がいまだ実験的に立証されていないなど、小脳の局所神経回路の機能的な解明はほぼ手がついていない。脳切片の実験に加えて、多点活動電位測定を生体脳でも行い（in vivo計測）、神経回路の機能的読み出しを目指す。AAVあるいは電気穿孔法でGEVIを発現させたマウスに頭蓋窓を作成する。細胞膜だけの非常に狭い領域のシグナルを検出する上で、呼吸や体動による細胞位置の動きがin vivo標本における最大の技術的課題となる。計画当初は対象をプルキンエ細胞と顆粒細胞としていたが、AAVによるGEVI発現手法の稼働により抑制性介在ニューロン（ゴルジ細胞・バスケット細胞）の細胞体あるいは神経終末での電位計測あるいはカルシウム計測とプルキンエ細胞・顆粒細胞の電位計測の同時施行が可能となりつつある。これにより、小脳皮質神経回路の挙動を介在神経を含めた複数の細胞種からの計測により行うことを構想している。