Elucidation of mechanism of inhibition by kinesin motor with structural and thermodynamic analyses and development of anticancer drugs
| Project/Area Number |
22K06554
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
横山 英志 東京理科大学, 薬学部生命創薬科学科, 教授 (70433208)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | キネシン / モータータンパク質 / 結晶化 / 構造解析 / ATPアナログ / 構造 / 熱分析 / 抗がん剤 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、キネシンCENP-Eモータードメインと阻害剤もしくはATPアナログとの複合体の立体構造をX線結晶構造解析で初めて決定し、他のキネシンEg5のADP結合構造、ATPアナログ結合構造、阻害剤結合構造と比較してCENP-Eの特徴的なATP結合と阻害剤による阻害の様式を解明する。また等温滴定型カロリメトリーで、立体構造だけでは得られない結合様式を熱力学的に解明する。さらに様々な化合物のin silicoシミュレーションを行い、有望な阻害剤を提案する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、X線結晶構造解析と熱分析（等温滴定型カロリメトリー）を主な手法として、細胞分裂期特異的なキネシンモータータンパク質であるCENP-Eとその阻害剤やATPアナログとの複合体構造を決定し、それら阻害剤による阻害の様式やATP加水分解の反応機構を解明することで、新規な抗がん剤を設計する構造基盤を得ることを目的とした。既存のタキサン、ビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤と異なり、キネシンモーターの阻害剤は非分裂期の微小管には作用しないため、副作用の少ない抗がん剤のリード化合物として期待できる。
昨年度までに、ヒトCENP-Eのモータードメイン（C末にHis tagを付与）の大量発現と精製の手法をすでに確立しており、その手法で精製サンプルを得たのち、タンパク質発現時から含まれる内因性のヌクレオチド（ADP）を酵素apyraseを用いて加水分解して除去し、非加水分解性ATP アナログであるAMPPNPを添加した複合体の結晶化を行い、放射光施設（つくば高エネルギー加速器研究機構）での1.9 Åと高分解能でのX線回折強度データの収集、分子置換法による構造解析を行った。得られた構造では、AMPPNPの電子密度が確認できた。このAMPPNP複合体構造を既に得られているADP複合体構造と比較して構造変化を考察し、異なるファミリーのキネシンモータードメインのAMPPNNP複合体構造と比較してCENP-Eの特徴的な構造を考察して、それら構造の詳細について論文に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. CENP-EモータードメインとATPアナログとの複合体の構造解析を行い、論文発表を行うことができた。
2. これまでの精製手法を用いてCENP-Eモータードメインと阻害剤との複合体の結晶化を進めており、良質な結晶が得られれば構造解析を行うことができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CENP-EモータードメインとATPアナログとの複合体の構造解析を初めて行い、論文で発表した。一方で、CENP-Eモータードメインと阻害剤との複合体構造はこれまで未解明であるため、複合体構造を初めて決定して各種阻害剤の結合様式を解明することができれば、新たな抗がん剤開発の構造基盤が得られると考えられる。CENP-Eモータードメインと阻害剤との複合体の結晶化を行うため、安定して結晶化を行うpHなどの条件検討を行い最適条件を見出したので、その条件で結晶化を行っている。結晶のX線回折強度データが得られたら構造解析を行う予定である。
さらにCENP-Eモータードメインとその阻害剤（数種）との熱分析を試みたがサンプルが凝集しやすくデータ収集ができなかった。より安定なpH条件を見出したためその条件で再度熱分析を行う予定である。これにより複合体のＸ線結晶構造解析だけでは得られない情報を得る予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(12 results)
