| Project/Area Number |
22K06562
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
真鍋 法義 東北医科薬科大学, 薬学部, 講師 (10392383)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | βグルカン認識 / レクチン受容体 / Dectin-1 / βグルカン / 多糖認識機構 |
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| Outline of Research at the Start |
外因性の病原体を非自己と認識して発動する免疫システムの多くは、哺乳類のレクチン受容体が、病原体の表面に存在する種特異的なβグルカンなどの多糖（糖鎖）を認識することで開始される。糖鎖の構造は多種多様であるにも関わらず、限られた数のレクチン受容体が各糖鎖リガンドへの親和性を獲得している機構は学術的に興味深く、原子レベルで解明すべき事柄である。本研究では、このレクチン受容体の巧妙な受容メカニズムを、構造生物学的に明らかにすることを目的とする。それにより、標的糖鎖の分岐構造・立体構造や受容体の協同性の視点から外来糖鎖認識メカニズムを解明し、免疫システムにおける多糖認識機構の礎を築くことを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までは、大腸菌を利用してマウスDectin-1およびヒトDectin-1の調製を行っていた。しかしながら、大腸菌によるタンパク質の調整では糖鎖の付加が行われない。特にマウスDectin-1においては、レクチン受容体に糖鎖修飾可能配列が2か所存在している。そのため、哺乳細胞を利用したマウスDectin-1およびヒトDectin-1の調製を開始し、配列の違いや糖鎖の有無による安定性や、βグルカンとの相互作用について検討を行った。その結果、哺乳細胞では大腸菌による発現とは異なる性状を示し、安定的なタンパク質の取得には工程を見直す必要が生じたが、取得自体は成功した。
質量分析において、マウスDectin-1および水溶性βグルカンの単体と、これらの複合体の分子量から、詳細な化学量論比の検討を行った。その結果、複合体を形成するβグルカンは、選別されている可能性が見出された。そのため、13Cの安定同位体標識を行ったマウスDectin-1を調製し、再度測定を行うことで化学量論比やβグルカンの選別について検討を行う。走査型プローブ顕微鏡からは、Dectin-1のβグルカンの認識における協調性においては、複数個のDectin-1が結合することで複合体が安定化されうることが確認できていた。そのため、結合・脱離の時間から解離定数の算出を行うため、プログラムの開発を行っている。
不溶性βグルカンとマウスDectin-1との結合実験に関する研究では、結合強度の方法論を論文化することで、βグルカン分岐頻度のみならずその集合様式によっても影響を受けることを報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Dectin-1の調製について、この2年で大腸菌を利用するだけでなく哺乳細胞での調製においてもプロトコールの検討を行うことができた。また、それによりβグルカンとの相互作用も変化し得ることが明らかとなってきた。これは、マウスDectin-1とヒトDectin-1の間のアミノ酸配列のわずかな変化や修飾糖鎖が、相互作用に影響を与えていることを示唆している。未だ、大量取得には至っていないため、引き続き条件の最適化を行っていく。
上記の相互作用様式については、質量分析や走査型プローブ顕微鏡の測定の解析を詳細に行うことで、着実に前進している。これは、安定同位体標識による測定や、解離定数を求めるプログラムの開発による。これらの開発の後、変異体や様々なβグルカンを使用することで認識機構がより解析できると考えている。
不溶性βグルカンとマウスDectin-1との結合実験に関する研究では、新規の簡便な手法を開発し、短時間で結果を得ることに成功した。そしてこの手法を論文化することができた。これにより、βグルカンの分岐頻度のみならずその集合様式によってもDectin-1との相互作用が影響を受けることも報告することができた。
計算化学的手法については、分子動力学計算に関する知見が集積できてきており、物理化学的実験の進行とともに計算を行う予定である。STD-NMRについては、哺乳細胞での発現が軌道に乗ってきたため、大腸菌により発現したDectin-1を利用するかも含めて検討し最適な試料を選択する段階と判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Dectin-1の調製について、それぞれの測定について、Dectin-1の発現を大腸菌で行うか哺乳細胞で行うかをそれぞれ判断し、取得を行う。哺乳細胞による取得の最適化については、単量体が安定的に取得できるよう、引き続き培養溶液、精製溶液などの組成から最適化を行う。得られた各種Dectin-1を用いて各種測定を行うことで、Dectin-1修飾糖鎖の役割や種差による相互作用や安定性変化に関して考察を行っていく。
Dectin-1のβグルカン認識における複合体形成様式に関しては、引き続き安定同位体標識を行ったDectin-1を利用した質量分析の測定とその解析、また走査型プローブ顕微鏡測定の開発するプログラムを用いた解析を行うことで、化学量論係数やリガンド結合の協調性について考察を行っていく。この結果とともに、安定的なDectin-1の取得が可能となった段階でSTD-NMRを行うことで、Dectin-1とβグルカンとの複合体やDectin-1同士の複合体形成に重要な残基や部位を決定する。これらから、複合体形成様式について議論を深めていく。
またこれまでの報告から、Dectin-1とβグルカンの複合体形成に影響を与えるβグルカン側の要因として、分岐頻度のみならずその集合様式があると報告している。これらの要因により、化学量論係数や解離定数が影響を受けるかを、様々なβグルカンを利用し各種測定を行うことで考察を行う。
上記を、分子動力学計算を用いても検討し、計算化学的手法的にも明らかとする。
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