Development of novel drug screening system for neuroblastoma by elucidating the transcriptional activation mechanism of glycosyltransferase

Research Project

Project/Area Number	22K06593
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
Research Institution	Nagaoka University of Technology
Principal Investigator	佐藤武史長岡技術科学大学, 工学研究科, 准教授 (30291131)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Keywords	神経芽腫 / 糖転移酵素 / 転写制御 / センサー細胞 / 薬剤スクリーニング / 転写活性化
Outline of Research at the Start	高リスク神経芽腫は予後が悪く、治療が難しい小児癌である。糖鎖は細胞の癌化に伴って構造が変化し、癌の悪性形質を担っている。これまでに、糖鎖の癌性変化を担う糖転移酵素の発現を制御し、糖鎖構造を改変することで癌の悪性形質を改善できることを見出してきた。最近、神経芽腫の悪性形質に関わる糖鎖を合成する糖転移酵素の基本的な転写制御機構を明らかにした。本研究では、この糖転移酵素の転写活性化機構を新しい治療ターゲットと考え、転写活性化の分子メカニズムを明らかにし、この知見を基に薬剤スクリーニングシステムを構築して薬剤の探索を試みる。
Outline of Annual Research Achievements	令和5年度はSp3とN-Mycのβ4-ガラクトース転移酵素 (β4GalT) 3の転写活性化への関与の分子メカニズム研究をさらに発展させ、これを薬剤スクリーニングに結びつけるための実験を実施した。前年度に得られた共免疫沈降実験の結果を検証するために、V5タグ付きのSp3 (V5-Sp3) を発現するためのプラスミドを作製した。このプラスミドをSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫に導入し、抗V5抗体とHoechst33342を用いた核対比染色により解析すると、V5-Sp3が核内で発現することが見出された。同様に、HAタグ付きのN-Mycを発現するためのプラスミドを作製した。これらのプラスミドをSH-SY5Y細胞に共導入し、それぞれの分子のタグに対する抗体を用いて共免疫沈降を行って、Sp3とN-Mycの相互作用を解析していく。次に、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化がSp3を介して行われているかを検討するため、Sp3ノックダウンプラスミドを作製した。このプラスミドをSH-SY5Y細胞に導入し、Sp3とβ4GalT3のmRNA発現やプロモーター活性を解析した。その結果、Sp3のノックダウンによってSp3のmRNA発現が低下し、β4GalT3のmRNA発現とプロモーター活性も低下することが示された。従って、Sp3はβ4GalT3の転写を正に制御することが明らかになった。今後は、N-Myc発現プラスミドとSp3ノックダウンプラスミドを共導入した細胞におけるβ4GalT3のmRNA発現とプロモーター活性を解析する。前年度に明らかにしたN-Mycによる転写活性化に関わる領域を、抗生物質耐性遺伝子を有するルシフェラーゼレポーターベクターに組み込んだ。このプラスミドをSH-SY5Y細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った結果、高いルシフェラーゼ活性が検出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和5年度は研究実施計画に基づいて実験を実施し、Sp3とN-Mycをタグ付きで発現するプラスミドを作製するとともに新しい知見が得られた。令和4年度に得られた共免疫沈降実験の結果を検証するために、V5-Sp3を発現するためのプラスミドを作製した。このプラスミドをSH-SY5Y細胞に導入すると、V5-Sp3が核内で発現することが見出された。同様に、HA-N-Mycを発現するためのプラスミドを作製した。また、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化がSp3を介して行われているかを検討するため、Sp3ノックダウンプラスミドを作製した。このプラスミドをSH-SY5Y細胞に導入すると、Sp3のmRNA発現が低下し、β4GalT3のmRNA発現とプロモーター活性も低下することが示された。従って、Sp3はβ4GalT3の転写を正に制御することが明らかになった。令和4年度に明らかにしたN-Mycによる転写活性化に関わる領域を、抗生物質耐性遺伝子を有するルシフェラーゼレポーターベクターに組み込んだ。このプラスミドをSH-SY5Y細胞に導入すると、高いルシフェラーゼ活性が検出された。以上の研究成果から、研究目的を、おおむね順調に達成できたと考えられる。
Strategy for Future Research Activity	令和6年度は、これまでのSp3とN-Mycのβ4GalT3の転写活性化への関与の分子メカニズム研究をさらに深化させるとともに、薬剤スクリーニングシステムを構築するため、以下の実験を予定している。令和5年度に作製したV5-Sp3とHA-N-Mycを発現するプラスミドをSH-SY5Y細胞に共導入し、両分子が核内で発現することを確認した後に、タグに対する抗体を用いた共免疫沈降によってN-MycとSp3の相互作用を解析する。また、HA-N-Myc発現プラスミドをSH-SY5Y細胞に導入し、クロマチン免疫沈降アッセイによりN-MycのN-Myc結合部位への結合を解析する。令和5年度に作製したSp3ノックダウンプラスミドとN-Myc発現プラスミドをSH-SY5Y細胞に共導入し、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化がSp3を介して行われているかを検討する。N-Mycのβ4GalT3のmRNA発現やプロモーター活性に及ぼす影響を解析するために、N-Mycノックダウンプラスミドを作製する。さらに、N-Mycによる転写活性化に関わる領域を組み込んだルシフェラーゼレポータープラスミドが導入されたSH-SY5Y細胞を選別するために、様々な濃度の抗生物質でこの細胞を処理して2週間で死滅する濃度を決定する。ルシフェラーゼレポータープラスミドをSH-SY5Y細胞に導入して、抗生物質存在下で培養することでセンサー細胞を樹立する。これら一連の実験をSp3とN-Mycが発現し、かつ外来遺伝子を効率よく導入・発現できるHEK293Tヒト胎児腎臓細胞を用いても行う。