Analysis of lipid domains around receptor tyrosine kinases by super-resolution microscopy
| Project/Area Number |
22K06609
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
阿部 充宏 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90415068)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
|
|---|
| Keywords | 受容体型チロシンキナーゼ / EGFR / 脂質ラフト / ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 / 超解像顕微鏡 / 一分子イメージング / 脂質ドメイン / 細胞膜 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
(i) 上皮成長因子受容体 (EGFR) と脂質との超解像解析，(ii) 脂質によるEGFRの活性制御機構の解析，(iii) EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼと脂質との解析を行うことで，受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか，受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか，を明らかにしたい。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
過去の生化学的な解析から、受容体型チロシンキナーゼは、脂質ラフトに局在することが示唆されていた。本研究では、「脂質プローブ」と「超解像顕微鏡法」とを組み合わせることにより、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか、を明らかにすることを目的とする。
本年度は、代表的な受容体型チロシンキナーゼであるEGFRが、どの脂質ドメインに存在するかを調べるために、EGFRと脂質プローブとの共局在解析を超解像顕微鏡によって行った。脂質プローブとして、SMに対してはEquinatoxin II、クラスター化したSMに対してはLysenin、SM/Chol複合体に対してはNakanori、Cholに対してはD4H、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PIP2) に対してはPLC delta-PH、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸 (PIP3) に対してはGRP1-PH、ホスファチジルセリン (PS) に対してはevectin2-PHを用いた。超解像顕微鏡の共局在率はRipley’s bivariate K-functionで評価した。その結果、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。ところが、EGF刺激後には共局在が低下することが分かった。一分子イメージング法でも検証した結果、同様の結果が得られた。この共局在の低下は、PLC gammaによって、EGFR周囲のPIP2が分解されるためであることが示唆された。
また、EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについて、ヒトのcDNAから50種類以上をクローニングし、次年度以降の超解像顕微鏡による解析のための準備を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
どうしてもクローニングできないものもあったが、9割程度の受容体型チロシンキナーゼがクローニングされた。得られたものについてのみ、解析を進める。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。次年度は、この共局在の意義を調べる。具体的には、PIP2に対するホスファターゼを細胞内で発現することによって、PIP2の量を低下させた場合のEGFRの活性を測定する。細胞全体だけではなく、光遺伝学的手法による局所的な脂質の分解も行う。EGFR活性は、抗リン酸化抗体によるwestern blottingにより行う。また、顕微鏡下でそれぞれの脂質の減少をモニターしながら、抗リン酸化抗体を用いて顕微鏡下で測定する。結果を検証するため、EGFRが活性化されたときにEGFRと結合する下流因子 (Grb2、 PLC gamma) について、超解像顕微鏡で共局在解析を行う。一連の実験データを考察し、なぜEGFRはEGF刺激前にPIP2ドメインに局在するか、なぜEGF刺激後には局在しなくなるか、の生理的意義について明らかにしたい。
また、本年度クローニングしたEGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについても、脂質ドメインとの共局在を超解像顕微鏡により調べる。
|
Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
