Antioxidant activity of nitrite and its physiological significance.

• Project/Area Number: 22K06645
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 47040:Pharmacology-related
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 土屋 浩一郎 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (70301314)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今西 正樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 助教 (00734344)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 亜硝酸イオン / EPR / スピントラップ / X線 / 細胞保護 / 亜硝酸塩 / 活性酸素 / 酸化ストレス / 亜硝酸 / 活性酸素種

Outline of Research at the Start

硝酸イオンは土壌を含む自然界に広く分布しており、植物や微生物等には重要な窒素源となっている一方、ヒトにとって不要な物質と考えられており、またこれらがヒトの健康に悪影響を与えることが示唆されて以来、それらを多く含む葉物野菜や根菜類の摂取が控えられる風潮があった。一方で硝酸イオンは体内で亜硝酸イオンに還元されることから我々は野菜の摂取を通じて日常的に硝酸・亜硝酸イオンを摂取している。本研究では、これまで申請者は体内での亜硝酸イオンの生理的意義を検討してきたが、本研究では亜硝酸イオンの新たな生理的役割の解明を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

前年度は、過酸化水素＋UV照射（365 nm）により発生させたヒドロキシルラジカル（.OH）による細胞障害を亜硝酸イオンが抑制すること、また、この系において、亜硝酸イオンが消費されることを確認していたが、2023年度は、この系中に存在する過酸化水素自身による細胞障害の可能性、および亜硝酸含有溶液の365 nmにおける光吸収の影響を除く目的で、水にX線を照射することにより.OHを生成することで、亜硝酸イオンの酸化ストレス軽減効果についてより詳細な検討を行った。
水にX線（4 Gy）を照射すると.OHと水素ラジカル(.H)が生成している事を電子スピン共鳴（EPR）-スピントラップ法で確認した上で、RAW 264.7細胞に対しX線（0-4 Gy）を照射し24時間後にMTTアッセイで細胞障害性を検討すると、照射量依存的に細胞生存率が低下していた。そこで照射線量を4 Gyとし、そこに1 mM亜硝酸イオンを添加すると細胞生存率の低下が抑制されたが、.OH消去剤として汎用されているDMSOを同濃度(1mM)共存させても細胞生存率を十分改善しなかった。
この違いを明らかにするため、水へのX線照射で生じる.OHへの消去活性をEPR-スピントラップ法で亜硝酸イオンとDMSOで比較したところ、DMSOよりも亜硝酸イオンの方が効率的に.OHを消去していることを見出し、さらに.OHと亜硝酸イオンが反応する際に、細胞保護効果を持つ窒素酸化物を産生していることをEPR-スピントラップ法で見出した。
さらに、亜硝酸イオンによる細胞保護効果の指標としてp21、p-γH2AX、Hif-1発現を用いる際の実験条件を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画期間中に4点（1．硝酸塩の抗酸化剤としての作用をin vitroで検証、2．種々の酸化ストレスに対する亜硝酸塩の防御作用の評価、3．炎症を惹起した実験動物を用いて亜硝酸塩の抗炎症作用の評価を行う、4．培養細胞実験、動物実験において亜硝酸による炎症/抗炎症関連遺伝子の発現と変動を評価）について実施する事にしていたが、2023年度は2022年度の実験結果（実施内容１，２）を補完するデータを得ることができた。また炎症/抗炎症関連遺伝子の発現と変動についても予備実験を行った。残りの研究期間で細胞実験・動物実験を実施し、これまでの結果をまとめたいと考えている。
以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

予備検討でRAW 264.7細胞を用い、過酸化水素＋UV刺激により３時間後にPARP活性化、p21、p-γH2AX、Hif-1発現の増加を見出している。
そこで次年度では亜硝酸イオンによる活性酸素種（.OH）に対するこれまでの検討結果に基づき、亜硝酸イオンの細胞保護効果を検討する。
また、全身炎症状態の実験動物モデルを作成し、亜硝酸塩による保護作用について検討を行う。