代謝改変を指向したアリストロキア酸生合成の鍵酵素の同定

Research Project

Project/Area Number	22K06680
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	寺坂和祥名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (60405214)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	アルカロイド / 生合成 / アリストロキア酸 / 酸化酵素 / 薬用植物 / 代謝改変
Outline of Research at the Start	アリストロキア酸（アルカロイド）は腎障害の原因化合物であるが、これが含まれる薬用植物の誤った使用により健康被害が起きた実例がある。植物でのアリストロキア酸の生合成酵素は同定されておらず、鍵となるステップは不明である。本研究では、アリストロキア酸生合成の鍵となる酵素を同定するとともに、毒性を有するものを低減し、有用化合物を増大させた植物の創出に向けた基盤技術を開発することを目的とする。アリストロキア酸の生合成機構を解明し、生合成エンジニアリングによりアリストロキア酸を低減し、有用化合物を増大した植物の創出へ発展させられれば、薬用植物の利用拡大が期待できる。
Outline of Annual Research Achievements	植物におけるアリストロキア酸の生合成のステップを明らかにし、鍵となる分子を同定することを目的とし、本年度は以下の研究を実施した。新規の酵素遺伝子を単離するため、昨年度までに取得していたウマノスズクサ植物体からのRNA-seqデータについては、候補遺伝子の解析を進め、重要と思われる酸化酵素の候補遺伝子を抽出した。分子系統学的解析から、既知のイソキノリンアルカロイド生合成酵素遺伝子との相同性についても解析した。この情報を元に今後遺伝子単離を進める。アリストロキア酸生合成の重要な酵素反応を解析するため、ウマノスズクサ植物体を用いた酵素活性解析について、まず材料として葉よりも根茎のほうが酵素活性が高く、解析しやすい可能性が示されたため、根茎を材料として継続的に使用できる植物体の栽培系を構築した。酵素活性解析では、酵素調製法の検討を行い、いくつかの反応系を検討したが、目的の酸化酵素活性を見出すまでには至っていない。同じ酵素画分を利用して、新たにアリストロキア酸をさらに代謝する酸化酵素の解析にも着手したが、こちらも活性の検出には至らなかった。アリストロキア酸含量を低減し、有用化合物生産へと転換した植物の創出に向けた基盤技術を開発することを目指し、ウマノスズクサの形質転換に必要な培養細胞系の構築を引き続き進めた。昨年度から継続した培養の結果、生育のよい培養細胞系統が得られた。この培養細胞では、アリストロキア酸は生産されないことが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 植物体から調製した酵素での目的の酵素活性の検出ができていないため、遺伝子の絞り込みに至っていない。形質転換系の構築については、培養細胞が確立でき、おおむね順調と考えられる。
Strategy for Future Research Activity	植物体から調製した酵素による酵素反応は、アリストロキア酸生合成に関わると推定される幅広い基質を試し、特に酸化酵素に関する情報を得るとともに、メチル化反応についても解析する。候補遺伝子の単離は、既知のイソキノリンアルカロイド生合成酵素との相同性も考慮して、遺伝子単離を行う。形質転換系の構築については、培養細胞への蛍光タンパク質遺伝子の導入法の検討を行う。