| Project/Area Number |
22K06747
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
八木 秀樹 国際医療福祉大学, 薬学部, 教授 (40250740)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 骨転移 / CCR1 / S1PR1 / 破骨細胞 / 破骨細胞誘導因子 / 癌幹細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
「肺癌細胞による破骨細胞誘導メカニズムと、正常の骨代謝で見られるそれは果たして同一であろうか？」この問いに対する答えが「否」であれば、正常骨代謝には影響を与えずに、骨転移による破骨細胞誘導が抑制でき、ここに標的分子を設定できれば、正常の骨代謝に影響を与えない骨転移抑制剤が創薬できる。申請者は簡便な骨転移の動物モデルを作製する過程で、高骨転移細胞株を樹立した。その性状を解析すると破骨細胞誘導活性がある培養上清中にRANKLが存在しないことに気付いた。正常な破骨細胞誘導にはRANKLは必須であることから、癌細胞による破骨細胞誘導は正常と異なると考えるとともに、新たな骨転移抑制薬の開発が期待できる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌治療において転移を抑制することは大変重要な課題である。特に骨転移では、激しい痛みを伴い、予後のみならずQOLも大きく低下させる要因となっている。骨転移の過程について考えてみると①原発巣からの離脱②血管内への侵入③転移先の指向性④転移先への定着といった過程が考えられる。これらメカニズムについて我々の樹立したヒト肺腺癌高骨転移株A549fm2細胞を用いて解析を行った。このA549fm2細胞は左心室移植ではなく、静脈内移入でも高率に骨転移を生じる細胞であり、この細胞を移植したモデルを用いて研究を行った。
①原発巣からの離脱であるが、元来腺癌であるので、上皮の性質を有しているが、高骨転移株ではEMTを生じていることが予想された。そこで、EMTに関与する転写因子Snail1の発現を比較したところ、親株に比して高骨転移株で発現上昇していた。②血管内への侵入については、リンパ球の血行への移行に関与するスフィンゴシン 1-リン酸 （S1P） 受容体-1の発現についてフローサイトメトリーにて検索したところ、親株に比して高骨転移株でS1PR1発現が上昇していた。③転移先の指向性については、ケモカイン受容体の発現を解析したところ、CCR1発現が高転移株で認められた。CCR1反応性のケモカインがマクロファージ経緯で産生されることから、マクロファージ系細胞株であるTHP-1の培養上清を用いて走化性を検討したところ、高骨転移株で高い走化性が認められた。また、その走化性はCCR1 antagonist で、抑制されたことから、CCR1による走化性であることが推定された。④転移先への定着については以前より報告の通り高骨転移株で破骨細胞誘導活性が高いことから説明できる。よって、高骨転移株であるA549fm2細胞は転移機構の各段階で、骨転移へ有利に性状を変化させていることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍の影響で遅れていた2022年度の遅れを回復できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
高骨転移性ヒト肺腺癌A549fm2細胞とその親株A549-p細胞との性状を比較することで、骨転移メカニズムの段階的解析を進めるとともに、肺癌細胞が導く破骨細胞誘導メカニズムを解明することで新規の骨転移抑制剤の開発を目指す。
癌幹細胞関連分子であるALDH、CD133、Lgr5、ABCG2の発現や幹細胞のniche停留に必要といわれるCXCR4発現などをフローサイトメトリーで解析する。癌幹細胞性はside population法やALDEFLUORを用いたフローサイトメトリーで解析し、必要があればセルソーターで細胞を単離し、それらの細胞から遺伝子を抽出、RT-PCRで解析する。転移関連分子としてepithelial-mesenchymal transition (EMT)関連分子として、snail, slug, twist, ZEB1, ZEB2など発現を、また破骨細胞誘導に関与するサイトカイン遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRによるRNA発現定量法にて行う。
新規破骨細胞誘導因子の探索に向けて、A549fm2細胞の培養上清を大量に集めて、硫安分画等を行い濃縮し、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、その分画をマウス単球細胞株RAW264.7細胞に添加、培養し、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ陽性多核巨細胞の出現を指標に破骨細胞誘導活性を測定する。
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