| Project/Area Number |
22K06794
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
田村 直輝 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70745992)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 高浸透圧ストレス / 非膜性オルガネラ / 液滴 / オートファジー / 電子顕微鏡 / 液-液相分離 / ストレス顆粒 |
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| Outline of Research at the Start |
本課題はストレス下で形成される非膜性オルガネラの性状変化を多様な形態学的手法によって解明することを目的とする。ストレス顆粒などの非膜性オルガネラは様々な神経変性疾患の原因となるが、環境変化に応じて性状が複雑に変化することから形成過程に不明な点が多い。そこで、本課題では高浸透圧ストレス下で形成される複数の非膜性オルガネラの形態を比較しながら多角的に解析することでその性状変化を明らかにする。具体的には、CLEM法、電子線トモグラフィー法、タイムラプス観察などを用いる。様々な手法で非膜性オルガネラの形態変化を詳細に捉えることでその性状を明らかにし、非膜性オルガネラに起因する疾患の解明へと繋げたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題はストレス下で形成される非膜性オルガネラの性状変化を多様な形態学的手法によって解明することを目的とする。ストレス顆粒などの非膜性オルガネラは様々な神経変性疾患の原因となるが、環境変化に応じて性状が複雑に変化することから形成過程のメカニズムに不明な点が多い。そこで、本課題では高浸透圧ストレス下で形成される複数の非膜性オルガネラ（p62顆粒およびストレス顆粒）の形態を比較しながら多角的に解析することでその性状変化過程を明らかにする。本課題は、計画A：微細構造解析（CLEM法など）、計画B：空間的解析（電子線トモグラフィーなど）、計画C：時間的解析（タイムラプス観察など）、そして計画D：生物物理学的解析（粘性プローブを用いた解析など）と４つのプロジェクトから構成されており、各プロジェクトが同時並行に進行する。現段階で、計画AとCは既に終了しており、得られたデータは2023年度の日本細胞生物学会と日本解剖学会において発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題は順調に進行している。概要の項でも記述したが、本課題は４つの計画によって構成されており、それぞれが並行して進行している。計画Aでは、CLEM法を用いて各顆粒の微細構造の解析を行い、既に良好なデータが得られた。また、計画CではmCherry-p62（p62顆粒マーカー）およびGFP-G3BP1（ストレス顆粒マーカー）を安定発現した細胞作製し、蛍光顕微鏡下でタイムラプス観察を行った。こちらも良好な動画データが得られた。以上から、計画AとCは当初の目的を既に達成したので計画を終了している。計画Bに関しては、計画Cで作製した細胞を用いて電子線トモグラフィー法およびアレイトモグラフィー法で現在解析中である。その際、p62顆粒の近傍にプロテアソームが集積していることを発見したので合わせて解析中である。計画Dに関しては、粘性プローブが結合するHalo-tagを各マーカー分子に付加し、Halo（細胞質マーカー）、Halo-p62（p62顆粒マーカー）またはHalo-G3BP1（ストレス顆粒マーカー）をそれぞれ安定発現した細胞を作製した。蛍光寿命顕微鏡下でこれらの分子を観察したところ期待したデータは得られず、各非膜性オルガネラの粘性度は測定できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は計画Bに集中して研究を進める予定である。現在、予定通りにp62顆粒やストレス顆粒の３次元的な構造を電子線トモグラフィー法およびアレイトモグラフィー法で解析中である。それに加えてp62顆粒とプロテアソームとの関係性にも焦点を当てて研究を行うことを計画している（本計画は計画B-2と位置付けている）。計画B-2に関しては、まずプロテアソームとp62顆粒の位置関係をCLEM法で解析する。既に、プロテアソーム構成分子の遺伝子にGFPがノックインされている細胞を東京大学のグループから供与してもらい、さらにmCherry-62を上乗せで安定発現する細胞の構築を行っている。この細胞を用いてCLEM解析を行い、良好な結果が得られたらさらにこれらの構造体の位置関係を電子線トモグラフィー法などで３次元的に解析する予定である。計画Dに関しては、残念ながら粘性プローブが期待した通りに機能しなかった。理由としては、粘性プローブにタンパク質を付加するとプローブの動きが制限されてしまい機能できなかったと考えられる。次年度が最終年度なので、ここから方針転換することはあまり有意義ではなく、計画Dは一旦凍結することとする。その分のエフォートを計画Bにまわし、計画Bの推進に尽力する。良好な結果が得られた場合は国内学会で発表し、国際学術誌に投稿する予定である。
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