非膜性オルガネラの多面的な形態学解析

Research Project

Project/Area Number	22K06794
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 48010:Anatomy-related
Research Institution	Fukushima Medical University
Principal Investigator	田村直輝福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70745992)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	液-液相分離 / オートファジー / ストレス顆粒 / 高浸透圧ストレス
Outline of Research at the Start	本課題はストレス下で形成される非膜性オルガネラの性状変化を多様な形態学的手法によって解明することを目的とする。ストレス顆粒などの非膜性オルガネラは様々な神経変性疾患の原因となるが、環境変化に応じて性状が複雑に変化することから形成過程に不明な点が多い。そこで、本課題では高浸透圧ストレス下で形成される複数の非膜性オルガネラの形態を比較しながら多角的に解析することでその性状変化を明らかにする。具体的には、CLEM法、電子線トモグラフィー法、タイムラプス観察などを用いる。様々な手法で非膜性オルガネラの形態変化を詳細に捉えることでその性状を明らかにし、非膜性オルガネラに起因する疾患の解明へと繋げたい。
Outline of Annual Research Achievements	本課題はストレス下で形成される非膜性オルガネラの性状変化を多様な形態学的手法によって解明することを目的とする。ストレス顆粒などの非膜性オルガネラは様々な神経変性疾患の原因となるが、環境変化に応じて性状が複雑に変化することから形成過程メカニズムに不明な点が多い。そこで、本課題では高浸透圧ストレス下で形成される複数の非膜性オルガネラ（p62顆粒およびストレス顆粒）の形態を比較しながら多角的に解析することでその性状変化過程を明らかにする。本課題は、計画A：微細構造解析（CLEM法など）、計画B：空間的解析（電子線トモグラフィーなど）、計画C：時間的解析（タイムラプス観察など）、そして計画D：生物物理学的解析（粘性プローブを用いた解析など）と４つのプロジェクトから構成されており、各プロジェクトが同時並行に進行する。現段階で、計画AとCは既に終了しており、得られたデータは日本細胞生物学会と日本解剖学会において発表した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本課題は順調に進行している。概要の項でも記述したが、本課題は４つの計画によって構成されており、それぞれが並行して進行している。計画Aでは、CLEM法を用いて各顆粒の微細構造の解析を行い、既に良好なデータが得られた。また、計画CではmCherry-p62（p62顆粒マーカー）およびGFP-G3BP1（ストレス顆粒マーカー）を安定発現した細胞作製し、蛍光顕微鏡下でタイムラプス観察を行った。こちらも良好な動画データが得られた。以上から、計画AとCは当初の目的を既に達成したので計画を終了している。計画Bに関しては、計画Cで作製した細胞を用いて電子線トモグラフィー法およびアレイトモグラフィー法で解析する予定であり、近日中に計画を開始する。計画Dに関しては、粘性プローブが結合するHalo-tagを発現するベクターを購入し、p62またはG3BP1をそれぞれクローニングした。さらに、Halo（細胞質マーカー）、Halo-p62（p62顆粒マーカー）またはHalo-G3BP1（ストレス顆粒マーカー）をそれぞれ安定発現した細胞を現在作製中である。粘性プローブの性質上、各マーカーを同時に発現することはできないので各マーカーを別々に発現させ、解析を行う予定である。
Strategy for Future Research Activity	次年度は計画Bと計画Dを当初の予定通りに進行させる。計画Bに関しては既に解析対象の細胞が作製済であり、この細胞をトモグラフィー解析に供するだけである。申請者が所属する講座は電子線トモグラフィーを用いた実験で実績があるので、計画Bは実現性が高いと考えられる。計画Dに関しては、まず各安定発現細胞の作製を行い、そのあと解析へと移行する。まず、Halo-tagを細胞質に発現した細胞を解析することで粘性プローブが我々の実験系で機能するかどうかを調べる。粘性プローブが機能する場合は、Halo-tag発現細胞を高浸透圧ストレスに曝し、ストレス強度、細胞質の粘度、および各顆粒の形成度合いがどのように相関するかを調べる。この相関性が分かれば、p62顆粒やストレス顆粒の形成度合いから細胞質の粘度やストレス強度を導き出すことが出来ると推測される。さらに、Halo-p62発現細胞およびHalo-G3BP1発現細胞も並行して解析し、各顆粒の粘度が高浸透圧ストレス下でどのように変化するかモニターする。良好な結果が得られた場合は国内学会で発表し、国際学術誌に投稿する予定である。