免疫寛容プラットフォームとしてのラット胸腺髄質の上皮細胞欠損領域の解析
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22K06797
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
沢登 祥史 獨協医科大学, 医学部, 助教 (40525052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 覚之 獨協医科大学, 医学部, 講師 (40436572)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | 胸腺 / 樹状細胞 / 線維芽細胞 / トランスクリプトーム / 免疫寛容 / T細胞産生 |
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| Outline of Research at the Start |
免疫応答の司令塔となるT細胞は、胸腺の髄質において胸腺上皮細胞と樹状細胞による選別を受け作り出されるが、ラットの胸腺髄質には胸腺上皮細胞が欠損した領域が存在する。これまで申請者らは、この髄質胸腺上皮細胞欠損領域に線維芽細胞と新型の樹状細胞が局在することを発見してきた。本研究課題では、この領域の持つ意義を、抗体を用いた特殊な染色や質量スペクトルを測定する装置を用いた顕微鏡観察や、線維芽細胞や樹状細胞の遺伝子発現を網羅的に解析するDNAマイクロアレイによって解析する。さらにその解析結果を元に、関連する遺伝子やタンパク質の機能を阻害し、髄質胸腺上皮細胞欠損領域の機能を生体内で確認する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
以下の小項目番号は申請書の研究実施計画に基づく。
「I-A: mEFAの組織学的解析」および、「II-A: mEFA細胞群のプロテオミクス解析」に記載されたmEFAに存在する細胞の単離と同定を行った。免疫組織化学解析からmEFAに局在すると予想されたCD103陰性新規DC候補細胞を単離しmRNAを抽出し、マイクロアレイ解析した。対照として、既知のcDCサブセットおよび脾臓のCD103陰性新規DC候補細胞を解析した。その結果、胸腺のCD103陰性新規DC候補細胞に特異的に発現する遺伝子として、Mmp14やApoc1などが見出された。この内Mmp14に対する抗体を購入しフローサイトメトリーを行い、胸腺のCD103陰性新規DC候補細胞に特異的に発現することを見出した。しかし、免疫染色ではMMP14発現は必ずしもmEFAに限定されず、さらなる細胞の探索が必要であることが示唆された。
「II-B: 線維芽細胞のトランスクリプトーム解析」を行うために、線維芽細胞の単離を試みた。しかし、市販のPDGFRb抗体はいずれも免疫組織化学染色では良好な染色を呈するが、フローサイトメトリー上では染色できないために、単離は難しいという結論に達した。現在、CD45陰性ストローマ細胞全体をソートし、シングルセル解析することにより線維芽細胞を含む胸腺ストローマ細胞全体のトランスクリプトーム情報を得ることを目指し、実験が進行中である。
「I-B: 質量顕微鏡によるmEFAの低分子マッピング」を進めるため、胸腺組織を質量顕微鏡で解析した。複数のマトリクスを用いて測定を繰り返し、髄質に存在する低分子化合物の候補としてホスファチジルセリン(36:1)およびオクソトリコシル酸などを同定した。
また、以上の結果の一部を第51回2本免疫学会学術集会（2022年12月、熊本）にて報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に記したように、胸腺と脾臓において、CD103陰性新規DC候補細胞、および対照群として既知のDCサブセットであるcDC1とcDC2のトランスクリプトーム解析を行い、今後探索すべき候補分子の情報を得た。一部の分子に関しては抗体を購入し、フローサイトメトリーと免疫染色にてその発現を確認した。
難航している胸腺内線維芽細胞のトランスクリプトーム解析に関しても、胸腺ストローマ細胞全体を単離してのシングルセル解析を実行し、胸腺内線維芽細胞を含めたストローマ細胞のトランスクリプトーム情報を得る予定である。
質量顕微鏡によるmEFAの低分子マッピングに関しても、胸腺髄質に存在する低分子化合物の候補としてホスファチジルセリン(36:1)およびオクソトリコシル酸などを同定した。
また、今後の実験のための予備検討として、ラット胸腺内マクロファージの同定と単離と、ラットにおける再凝集胸腺組織培養を行い、良好な結果を得ている。
以上のように、次年度に発展が期待される研究成果が出てきており、研究は概ね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
CD103陰性新規DC候補細胞のキャラクタリゼーションを更に進めるため、「対照群としての胸腺マクロファージ単離」と「再凝集胸腺組織培養によるCD103陰性新規DC候補細胞の機能解析」が進行中である。胸腺マクロファージは、HIS36を指標としてすでに単離が進んでおり、十分な細胞数が単離され次第mRNAを調製しマイクロアレイ解析を行う予定である。再凝集胸腺組織培養はラットによる実施例が少ないため実験系の構築から始める必要があるが、胎生19日のラット胎児の胸腺をin vitroで再凝集させ、T細胞の新生を再凝集組織内で進行させることに成功した。今後新規DC候補細胞及び対照cDCを加え、T細胞新生の速度への影響を計測する。さらに、マイクロアレイにより判明した新規DC候補細胞が特異的に発現する遺伝子（Mmp14など）の機能への寄与を検討するため、これらの遺伝子産物への阻害剤を再凝集胸腺組織培養に加える。
PDGFRb陽性線維芽細胞に関しては、これらを含むストローマ細胞群を一括してのシングルセル解析を令和5年度中に実行する。これにより、PDGFRb陽性線維芽細胞のトランスクリプトームの情報が得られると同時に、マウスに比べ解析の遅れているラット胸腺上皮細胞のトランスクリプトームも明らかになることが期待される。これらのデータから、PDGFRb陽性線維芽細胞の機能の推定及び同定のための表面マーカー探索を行う。
胸腺の質量顕微鏡解析の結果得られた候補物質の情報および、線維芽細胞のシングルセル解析によって得られるであろうトランスクリプトーム情報を応用して線維芽細胞を単離し、mEFA細胞群のプロテオミクス解析を行う。トランスクリプトームとプロテオームの両方から線維芽細胞およびmEFAにアプローチし、これらの細胞と領域の機能を解析する。
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Report
(1 results)
Research Products
(1 results)
