DNA修復時の「足場」として働く核膜でのリン脂質代謝の機能

• Project/Area Number: 22K06804
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48010:Anatomy-related
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 田中 俊昭 山形大学, 医学部, 客員研究員 (70536987)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: DNA二重鎖切断 / DNA修復 / ジアシルグリセロールキナーゼ / DNA修復タンパク複合体 / 核膜 / zeta型DGK / DNA修復複合体

Outline of Research at the Start

DNA修復過程において、切断化されたDNAが核膜へ融合することから、DNA修復の「足場」として核膜が重要である。しかし、DNA修復時における核膜の脂質二重膜上のリン脂質代謝の機能的役割については、全く解明されていない。そこで本研究は、DNA修復時の核膜上のリン脂質代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ（DGK）ファミリーの機能解析を中心に以下の研究を実施する。
・DNA修復過程における核膜脂質二重膜の構造解析
・DGKファミリーを介した切断化DNAの核膜融合メカニズムの解析
・核膜上のDNA修復タンパク複合体形成におけるDGKファミリーの作用
・DNA修復分子の活性化機構の解明

Outline of Annual Research Achievements

DNA二重鎖切断が生じた際に行われるDNA修復時における核膜の脂質二重膜上のリン脂質代謝酵素、特にzeta型DGKの機能を介したDNA修復のメカニズムを明らかにするために、DNA二重鎖を切断する薬剤（エトポシド・アクチノマイシンD）を添加し、DNA修復過程において変化が認められるタンパクを検索した。
その結果、DNA-PKcs, BRCA1といったDNA修復に不可欠なタンパク質のリン酸化がｚ型DGK欠失細胞では起こりにくいことが明らかとなった。その結果、ｚ型DGKが欠失すると、DNA修復が著しく遅延しDNA修復過程に大きな障害がでることが明らかとなった。
この知見は、核膜上に集積するDNA修復タンパク複合体形成において、DGKファミリーが重要な役割を担っており、核膜上に集積するDNA修復タンパク複合体とDGKファミリーが深く関与することを示唆するものである。
ｚ型DGKの有無によって、DNA修復タンパク複合体の形成が遅延または阻害されることから、DNA修復過程においてｚ型DGKが核膜においてDNA修復タンパク複合体をリクルートする働きやDNA修復タンパク複合体のスキャフォールドとして機能している可能性が予想される。
今後は、さらにタイムラプスイメージングや免疫電子顕微鏡を用いて、DNA修復タンパク複合体とDGKファミリーと相互作用が核膜上でどのように働いているのかを検証し、主にｚ型DGKの挙動を探索していく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

DGKファミリーのうち、ｚ型DGKの欠失細胞やノックダウン細胞を用いた実験で、DNA二重鎖切断からのDNA修復過程において、DNA修復タンパク複合体の形成がｚ型DGKの有無によって変化することを見出した。この実験結果は、核膜上に集積するDNA修復タンパク複合体の足場としてDGKファミリーが関与することを示唆している。さらに解析を進めるために、DGKファミリーと相互作用する特定分子を質量分析ならびに次世代シークエンサーにて検索している。今後は、DGKファミリーと特に強い相互作用を有したDNA修復関連分子を同定する。様々なDGKアイソザイムを欠失した際に、DNA修復タンパク複合体の構造および構成要素に変化があるかを検証し、DNA修復能にもたらす影響を検証する予定である。

Strategy for Future Research Activity

今後は、DNA損傷により切断されたDNAが、核膜へと移動・癒合することによって、クロマチン再配置が起こり、このことがDNA修復に重要であることが示唆されている。この一連の過程における核膜のDGKファミリーをGFPにて蛍光標識し、その動的変化を蛍光ライブイメージングにて解析する。また、核膜上での切断されたDNAとDGKファミリーの相互作用を各種DGKアイソザイムの特異抗体を用い、クロマチン免疫沈降法により検討する予定である。