ゼブラフィッシュのプロテオーム解析による一次線毛動態制御因子の探索と機能解析

Research Project

Project/Area Number	22K06882
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
Research Institution	Mie University
Principal Investigator	白水崇三重大学, 医学系研究科, 助教 (00582678)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	稲垣昌樹三重大学, 医学系研究科, 客員教授 (30183007) 西村有平三重大学, 医学系研究科, 教授 (30303720)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	一次線毛 / ゼブラフィッシュ / プロテオミクス / プロテオーム解析
Outline of Research at the Start	細胞膜上に存在する小さな不動性の突起である一次線毛は細胞内外のシグナル伝達に働き、その構造形成および機能に関する遺伝子の異常が線毛病と言われる一連の疾患を引き起こすことが知られている。しかしながら、一次線毛形成のメカニズムには未解明な点が多く、その全貌は明らかにされていない。そこで本研究では、プロテオーム解析によりこの経路の制御に関わるタンパク質を網羅的に同定し、ゼブラフィッシュを用いたin-vivo解析によりその機能を評価することにより、一次線毛の形成を制御する機構を解明することを目的とした。
Outline of Annual Research Achievements	【研究目的】細胞膜上に存在する小さな不動性の突起である一次線毛(Primary cilia)は細胞内外のシグナル伝達に働き、その構造形成および機能に関する遺伝子の異常が線毛病と言われる一連の疾患を引き起こすことが知られている。また一次線毛を介したシグナル伝達が、細胞の増殖や停止に関わることが示唆されたことから、一次線毛の動態制御メカニズムの解明が、新たながん治療の標的に繋がることが期待されている。我々はこれまでに、一次線毛形成に関わる遺伝子としてトリコプレインを同定し、ユビキチン・プロテアソーム系を介した制御により、一次線毛の形成抑制に働くことを明らかにしてきた。しかしながら、ユビキチン・プロテアソームを介した一次線毛形成のメカニズムには未解明な点が多く、その全貌は明らかにされていない。そこで本研究では、プロテオーム解析によりこの経路の制御に関わるタンパク質を網羅的に同定し、ゼブラフィッシュを用いたin-vivo解析によりその機能を評価することにより、一次線毛の形成を制御する機構を解明することを目的とした。【令和５年度の成果】 TCHPノックアウトゼブラフィッシュの組織を用いたプロテオーム解析の結果から、新規の一次線毛シグナル関連遺伝子の絞り込みを行った。具体的には、発現変動遺伝子において、過去に報告された機能から組織再生との関連が示唆される分子を選び、qPCRによる発現変動の検証実験を行った。その結果得られた候補分子を、新規一次線毛シグナル関連候補分子とした。さらに、その候補分子の特異的抗体を作成し、in-vivoでの検証実験の系を立ち上げた。今後は、その候補分子の一次線毛との関連について詳細な検討を進める予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度はプロテオーム解析の結果から、一次線毛シグナルに関わる新規分子の候補を絞り込むことができた。過去の報告からは一次線毛との関わりは未知であるが、qPCRによる発現変動の検証により、プロテオーム解析の結果と同じくTCHPノックアウト個体での発現変動を確認することができた。また、ターゲット分子の特異的抗体が作成できたことや、新たなin-vivo実験系を立ち上げることが出来たので、今後の詳細な分子メカニズムの解明を進めることが可能だと思われる。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策として、まずは標的遺伝子のin-vivoでの機能解析を行う予定である。具体的には、標的遺伝子の発現プロファイルを特異抗体やIn-situ hybridizationを用いて調べる。また、組織再生における標的分子の役割と一次線毛との関連について評価を行う予定である。