エピゲノム編集技術によるレット症候群の新規治療方法の開発

Research Project

Project/Area Number	22K06896
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
Research Institution	Kanazawa University
Principal Investigator	堀家慎一金沢大学, 疾患モデル総合研究センター, 准教授 (40448311)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	レット症候群 / エピゲノム編集 / エピジェネティクス
Outline of Research at the Start	レット症候群（RTT)は，主に女児に発症するX連鎖性顕性遺伝病で，乳児期から重度の進行性発達障害をきたし，生涯を通じて治療と療育が必要であり医療ニーズが高いが，未だ有効な治療法がない。そこで本研究では，「X染色体不活化」により不活性化されてはいるが正常な患者の遺伝子を活用するという新たな発想によるRTT治療法の確立を目指す。エピゲノム編集技術を用い，不活性化されている正常なMeCP2遺伝子のエピゲノムを改変し，活性化することで，生理的な遺伝子量に近づける事が可能となる。これにより，RTTに革新的治療をもたらすだけでなく，エピゲノム機構が関連する他の疾患治療への応用を提供することができる。
Outline of Annual Research Achievements	レット症候群（RTT）は，女児に発症する神経発達障害であり，X染色体上のMeCP2遺伝子変異が原因である。これまでの研究で，MeCP2の機能不全はターゲットとなる下流遺伝子の発現変化を誘発し，筋緊張の低下やてんかん・側弯・知的障害などの多彩な症状を引き起こす。興味深いことに，ヒトの生後半年程度に相当する3週齢のMecp2-KOマウスに正常なMecp2を補うと運動障害の改善が認められたことから，RTT患者でも正常MeCP2の適切量を補うことでRTTの治療の可能性が示唆された。すなわち，RTT患者にアデノ随伴ウイルス（AAV）で正常なMeCP2を導入することは，RTTの有効な治療手段と考えられるが，一方でMeCP2の過剰はMeCP2重複症候群を引き起こすことが知られている。したがって，RTTの治療においてMeCP2の正確な遺伝子量コントロールが要求されるが、AAVで導入した外来遺伝子の量的コントロールは非常に難しく，脳部位特異的なMeCP2遺伝子量を担保することが困難である。そこで本研究では，RTT患者が持つ正常なMeCP2をエピゲノム編集によって活性化させることによる機能回復をめざす。本年度は，MeCP2遺伝子の転写調節領域に関しては，ルシフェラーゼアッセイによりMeCP2転写開始点から「-179bp~-309bp」の領域がMeCP2遺伝子のコアプロモーター領域であることを明らかにした。また，このコアプロモーター領域内の６つのCpGが不活性化X染色体特異的にメチル化されていることを見出した。そこで，この６つのCpGをエピゲノム編集のターゲットとし，４つのガイドRNAを設計し脱メチル化効率を神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にて精査した。その結果，gRNA4を用いた際，約15%~20％の脱メチル化が誘導され，それに伴い，MeCP2遺伝子の発現が1.3倍に上昇することを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason MeCP2プロモーター領域における脱メチル化ターゲット領域を同定した。また，様々なgRNAを用いた脱メチル化を試みた結果，15％前後の脱メチル化を誘導することに成功した。しかしながら，脱メチル化の効率は，非常に限定的であり，何らかの改善を必要とする。
Strategy for Future Research Activity	対象とする細胞株において，不活性化X染色体上のMeCP2を識別できるようなシステムを構築する。その上で，初年度，行ったエピゲノム編集の最適化を目指す。特に，脱メチル化の効果が限定的であった理由として，XIST RNAの存在，ヒストンH3K27me3などの影響があると考えられる。そこで，XISTのノックアウトやヒストンH3K27me3の脱メチル化などを組み合わせることで脱メチル化の効率の工場を目指す。