細胞分裂数を記録する人工遺伝子の開発

• Project/Area Number: 22K06898
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 長岡 仁 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (20270647)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 克哉 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60733508)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: TN3 resolvase / dCas9 / DNA組換え / 細胞分裂 / 人工遺伝子 / 遺伝子組換え

Outline of Research at the Start

生物個体が受精卵から成体へと成長しその寿命を終えるまで、体細胞は分裂を繰り返しながら様々な細胞に分化する。ヒトの体細胞はおよそ40-50回ほど分裂していると推定できるが、様々な系譜の細胞につき、分裂の経緯を観察し体系的に比較する手段は無い。本研究では、配列特異的かつ細胞周期依存的なDNA組換え酵素を人工的に作成し、その酵素に依存する、人工標的遺伝子のDNA欠失を指標とすることで、ある時点からの細胞の分裂回数を推定できるというシステムを開発する。本研究により、正常/異常状態での個体発生の細胞系譜とその異常をより詳細に解析していくための基盤が得られると期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、さまざまな細胞において、細胞分裂数をモニタリングできる人工構築を開発することを目的とする。そのため、新たに、認識配列を容易に操作でき、多様な配列特異的組換えを誘導できる人工酵素を作成することが第一目標である。
TN3 resolvaseのcatalitic domainに、転写因子egr1の３連のジンクフィンガー(ZF)DNA結合ドメインを融合させたタンパク質（TN3-L6-ZF3）の、大腸菌用の発現コンストラクトを作成した。また、二カ所の人工的組換えシグナルをもち、組換え反応をGFP蛍光喪失で検出できる標的構築を、p15Aオリのプラスミドで作成し、これらを用いて実際に組換え反応が、高率に起きること、また、３連のZFを一つもしくは二つ欠くと（TN3-L6-ZF2及びTN3-L6-ZF1）組換は全く起こらないことを確認した。
次に、組換え標的配列の柔軟性を担保するために、TN3-L6-ZF1のC末端側にdCas9の配列をGGSリンカーを挟んで付加した発現プラスミドを作成した。dCas9用のsgRNAを2種同時に発現させるため、Lacプロモーター制御下に、自己切断能を持つribozymeの配列を挟んで２種類のsgRNAを発現するように設計したコンストラクトをpSC101オリを持つプラスミドで構築し、タンパク質とガイドRNAと組換え標的の三種プラスミドが併存して組換え反応を検出できる系を構築した。その結果、GFP喪失は顕著ではないが、PCR法による組換え検出により、想定通りに配列特異的組換が起こることが確認された。
この結果は、新たに設計した人工組換え酵素は想定通り組換えを起こす事、また今後リンカー長やガイド位置などの細かい条件を検討して最適化を進める必要があるが、そのための系が構築できた、という事を示しており、計画実現に向けての重要な進歩である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

厳密に言えば、組み換え酵素の最適化を初年度に完了する予定であったが、以下の想定外の微細な、手順およびプラスミドに変更の必要が生じたため、最適化は完了していない。
１）人工の組換え配列を左右対称として設計していたが、構築の際に原因不明でプラスミドに導入できなかった。結局、試みに左右非対称の配列に変更することで導入できたが、解決まで時間を要し、遅延が生じた。
２）１）の変更により、sgRNAを同時に２種類、大腸菌内で発現させることが必要となった。そのため急遽、pSC101オリジンを持つプラスミドを導入することとしたが、マイナーな変更であったものの、プラスミド系の変更に当たると考えられたので、組換えDNA実験計画の変更届けを所属機関に提出して、その審査を受ける必要があると判断した。

Strategy for Future Research Activity

当初計画より多少の遅延があるとはいえ、システム開発としては、マイナーな変更を経ながらも、期待通りの結果が得られており、酵素の最適化と、その次のステップとしてのシステムの真核細胞への適用に向けて計画通り進めていく予定である。