長鎖非コードRNAによるTLS相分離を介した新規の転写制御機構の解明
Project/Area Number |
22K06904
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
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Research Institution | Saitama Medical University |
Principal Investigator |
黒川 理樹 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70170107)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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Keywords | 長鎖非コードRNA / TLS / FUS / 相分離 / ALS / 天然変性領域 / IDR / 転写制御 / RNA結合タンパク質 / TLS/FUS / 神経変性疾患 |
Outline of Research at the Start |
私達は、新規の長鎖非コードRNA(lncRNA)がRNA結合タンパク質TLS/FUSに結合してcyclin D1遺伝子の転写を抑制することを示した。TLSは相分離を誘導し沈殿すると神経変性疾患であるALSを惹起する。また、相分離は転写を制御する。私達は、lncRNAがTLSによる相分離を抑制することも示した。以上より「lncRNAはTLSの相分離に作用し転写を制御するのか」という問いを着想した。これを解くために、次の目的を設定する。HeLa細胞総RNAからTLSに結合する新規lncRNAを検出する方法を確立する。このlncRNAから、相分離と転写を抑制するものを同定する。これらを実施する。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究の核心をなす問いは、「lncRNAはTLSの相分離に作用し転写を制御するのか」である。これに答えるために目的を設定した。目的は、相分離により形成される液滴に作用して転写を抑制するlncRNAを見いだすことである。これにより、新規の転写抑制機構を示すことになる。この目的を達成するために、2022年度はTLSに結合するlncRNAの検出法の確立を目指した。具体的には、GST-TLSにヒトHeLa細胞総RNAを結合させ、lncRNAを検出する方法を確立した。まず、大腸菌発現のGST-TLSを調製して、内因性の大腸菌RNAをMicrococcal Nuclease処理で除去した。このGST-TLSにHeLa細胞総RNAを結合させた。結合RNA画分から、RNA精製キットでTLS結合RNAを調製した。このTLS結合RNAから相補的なCyanine3標識のcRNAを合成し、ヒトlncRNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。シグナル強度をスキャナーで測定した。出発物質であるHeLa細胞総RNAから、精製されたGST-TLS結合RNAの中でシグナルが2倍以上に上昇したRNA配列は1700種類以上が見いだされた。これらの配列で、10倍以上増加したRNAが50件ほど、20倍以上が10件以上となった。次年度は、これらのlncRNAが実際にTLSに結合し、相分離制御作用を有するかを検証していく。この成果は、相分離に作用して転写を抑制する新規のlncRNAを同定することになる。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、Ⅰ.TLSに結合するlncRNAの検出法の確立、Ⅱ.TLSに結合するlncRNAの検証,Ⅲ.目的のlncRNAを選択する実験法の確立、以上3項目を3年間で実行する実験計画を作成した。初年度で、Ⅰを終えてⅡに入ろうとしているので、計画は順調に進展しているといえよう。
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Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、初年度で得られたRNA配列がTLSに結合することを検証する。シグナルが20倍以上に上昇したlncRNA配列からビオチン標識RNAオリゴを合成して、実際にTLSと結合することを確認する。現在までに上位4種類のRNA配列について、GST-TLSへの結合とHeLa細胞核抽出液(NE) 中のTLSとの結合が確認された。予備的実験により、上位4種類のlncRNAがTLSと結合した。初年度までに得られた1700種類ほどのRNA配列に関して、実験的にTLSに結合する新規lncRNAであることを検証する予定である。これを達成後は、TLSに結合するlncRNAから、相分離を制御するものを選択していく予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)