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G蛋白活性調節因子を標的とした治療の基礎検討

Research Project

Project/Area Number 22K06933
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 49010:Pathological biochemistry-related
Research InstitutionAichi Medical University

Principal Investigator

佐藤 元彦  愛知医科大学, 医学部, 教授 (40292122)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 山村 彩  愛知医科大学, 医学部, 講師 (40633219)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords転移性前立腺がん / ホルモン抵抗性前立腺がん / G蛋白質 / 細胞内情報伝達 / 三量体G蛋白 / 細胞内情報伝達系
Outline of Research at the Start

ホルモン非感受性の転移性前立腺癌の治療には一層の改善が求められている。最近、申請者はヒト転移性前立腺癌細胞にG蛋白活性調節因子(Activator of G-protein signaling 8、AGS8)が高発現しているという予備検討結果を得た。本研究では、AGS8が前立腺癌の新規治療標的となるか、癌細胞のAGS8を抑制し増殖抑制効果を検討する。

Outline of Annual Research Achievements

DU145細胞へのsiRNA導入をエレクトロポレーションにより行い、AGS8発現をquantitative PCRの検出限界程度までノックダウンすることに成功した。ノックダウンした細胞を用いて内因性AGS8の変化をウェスタンブロットで検討したが、明確な変化を確認できなかった。そこで、より高いレベルのAGS8を発現するがん細胞株を探索し抗体の有効性を検討した。メラノーマ細胞G-361細胞がAGS8をより高いレベルで発現することを確認した。抗体(PA5-56603)は正常メラノサイトよりG-361細胞で強く発現する200kD付近のバンドを描出した。これは、quantitative PCRの結果と一致した。内因性AGS8の検出に抗体(PA5-56603)が有効であると考えられた。
次に、AGS8をノックダウンしたDU145細胞を用いてMTTアッセイを行ったが明確な効果は確認されなかった。G-361細胞でもAGS8siRNAによるノックダウンを行ったが、やはりMTTアッセイで明確な低下は確認されなかった。quantitative PCRでは十分なノックダウンが得られたが、ウェスタンブロットでは蛋白が確認されており、AGS8蛋白レベルの十分な低下には他の方法が必要と考えられた。
AGS8発現抑制によるシグナル変化としてHUVECで確認できているVEGF受容体と下流シグナル分子(ERK、AKT、p38MAPK)のリン酸化を検討した。AGS8を高発現するG-361細胞で、AGS8ノックダウン後も明確は変化を確認できなかった。
ヒト正常前立腺上皮細胞および前立腺癌細胞を化合物X存在下で培養し、遊離LDH測定によりED50を求め、化合物Xの毒性を検討したが、明確な毒性は検出されなかった。また、AGS8阻害薬Xは30μg/mlの濃度で、DU145細胞の遊走を約40%抑制した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度に問題があったsiRNAによるAGS8のノックダウンはエレクトロポレーション法の諸条件を検討することにより完了することができた。また、内因性AGS8蛋白のウェスタンブロット法による検出も有効な抗体を確認することができた。さらに、この過程でDU145細胞より高レベルでAGS8を発現するメラノーマ細胞株、G-361細胞を見出すことに成功した。一方、quantitative PCRでは十分なノックダウンが得られたにもかかわらず、ウェスタンブロットで確認される蛋白の減少は限定的であり、AGS8蛋白レベルの効果的な低下には他の方法が必要と考えられた。ノックダウン細胞でも一定レベルのAGS8蛋白発現が確認されており、この状態ではMTTアッセイ、シグナル解析では明確な変化を確認できなかった。しかし、全体としては計画した実験を進め一定の結果を得たので、おおむね順当に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今回用いたsiRNAノックダウン後48時間では蛋白発現レベルの低下が十分ではなかった。次年度は48時間のみではなく、72時間後、96時間後のポイントでも細胞から蛋白を回収し、ウェスタンブロットにより内因性AGS8蛋白の低下の程度を確認する。効果的な蛋白低下が見られれば、MTTアッセイおよび細胞内シグナル解析を行う。
一方、蛋白に作用するAGS8阻害薬Xからは想定された結果が得られている。次年度は、ヌードマウスにDU145細胞を移植する。治療群ではAGS8阻害薬Xを局所に注射し、移植後、1から4週で腫瘍塊を摘出し、重量および大きさを比較検討する。また、ヒト前立腺がん組織でのAGS8発現を免疫染色により検討し、組織悪性度の関連を検討する。

Report

(1 results)
  • 2023 Research-status Report
  • Research Products

    (14 results)

All 2024 2023 2022

All Presentation (12 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Presentation] Overexpression of ROCK2 promotes Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) and metastasis in prostate cancer.2024

    • Author(s)
      Hossain A, Yamamura A, Nayeem MJ, Takahashi R, Sato M.
    • Organizer
      第101回日本生理学会大会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 網膜における間葉系幹細胞由来細胞外小胞の役割.2024

    • Author(s)
      林寿来, 佐藤元彦
    • Organizer
      第101回日本生理学会大会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 自己増幅型RNAを用いた希少遺伝性疾患新規治療法の開発研究.2024

    • Author(s)
      家﨑高志, 佐藤元彦
    • Organizer
      第101回日本生理学会大会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 肺動脈性肺高血圧症におけるHippoシグナル.2024

    • Author(s)
      山村彩, Hossain A, 佐藤元彦
    • Organizer
      第101回日本生理学会大会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] コロソリン酸によるPDGF受容体発現低下を介した肺高血圧症細胞の増殖抑制.2023

    • Author(s)
      山村彩, Hossain A, 高橋理恵, 佐藤元彦
    • Organizer
      第143回日本薬理学会近畿部会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] G蛋白活性調節因子による病態調節.2023

    • Author(s)
      佐藤元彦
    • Organizer
      大学共同利用機関法人自然科学研究機構 生理学研究所 所長招聘セミナー
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      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] Pathological role of ROCK2 in the aggressive metastatic phenotype of prostate cancer.2023

    • Author(s)
      Hossain A, Yamamura A, Nayeem MJ, Takahashi R, Sato M.
    • Organizer
      次世代を担う若手のための創薬・医療薬理シンポジウム2023
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  • [Presentation] 肺高血圧症における性ホルモンとHippoシグナル.2023

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      山村彩, Hossain A, 髙橋理恵, 佐藤元彦
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      2023年度生理研心血管研究会
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  • [Presentation] 肺動脈性高血圧症におけるHippoシグナルとPDGF受容体の関与.2023

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      山村彩, Hossain A, 高橋理恵, 佐藤元彦
    • Organizer
      第70回中部日本生理学会
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  • [Presentation] Overexpression of ROCK2 correlates with aggressive metastatic phenotype in prostate cancer.2023

    • Author(s)
      Hossain A, Yamamura A, Nayeem MJ, Takahashi R, Sato M.
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      第70回中部日本生理学会
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  • [Presentation] Self-amplifying RNAを用いた遺伝子疾患治療法の開発研究.2023

    • Author(s)
      家﨑高志, 佐藤元彦
    • Organizer
      第70回中部日本生理学会
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  • [Presentation] コロソリン酸による肺動脈性肺高血圧症細胞の増殖抑制効果.2023

    • Author(s)
      山村彩, Hossain A, 高橋理恵, 佐藤元彦
    • Organizer
      第97回日本薬理学会年会
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  • [Book] 生理学用語ハンドブック(日本生理学会監修, 日本生理学会用語委員会編)2024

    • Author(s)
      佐藤元彦(用語解説分担執筆)
    • Total Pages
      324
    • Publisher
      丸善出版
    • ISBN
      9784621309087
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      2023 Research-status Report
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 癌治療薬2022

    • Inventor(s)
      佐藤元彦 , 梅澤一夫 , 山村彩
    • Industrial Property Rights Holder
      学校法人 愛知医科大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Filing Date
      2022
    • Acquisition Date
      2023
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      2023 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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