硫酸化糖鎖に着目した胆管細胞におけるムチンコアタンパク質の機能解析
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22K06977
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49020:Human pathology-related
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
星野 瞳 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (90500710)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 基弘 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (00362137)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | ムチン / 硫酸化糖鎖 / 遺伝子発現ベクター / ウェスタンブロット / 免疫沈降 / 肝臓 / 糖タンパク質 / 肝内胆管 / 細胆管反応 |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らは最近，肝内胆管末梢部，細胆管癌，細胆管反応のいずれにおいても硫酸化シアリルルイスX（sLeX）糖鎖が腺管内腔面に発現していることを明らかにした。そこで硫酸化sLeX糖鎖で修飾されたムチンコアタンパク質（糖タンパク質）を発現するモデル胆管細胞を作製し，胆管細胞におけるこの糖タンパク質の機能を明らかにすることで，細胆管癌および細胆管反応の発生機序を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、硫酸化糖鎖で修飾されたムチンコアタンパク質の胆管細胞における機能を明らかにすることである。令和4年度の研究実施計画は、硫酸化糖鎖のコアタンパク質と考えられたムチンXの遺伝子をクローニングして遺伝子発現ベクターを作製すること、さらに細胞株を用いたタンパク質発現解析を行うことであった。当初はムチンX cDNAを複数に分けて遺伝子増幅したのち、それらを連結させることで全長cDNAを入手する予定であった。しかしながら、市販のムチンX遺伝子発現ベクター入手することができたため、このムチンX遺伝子発現ベクターを使用して実験を行うことにした。まず始めに、ムチンX遺伝子発現ベクターに組み込まれたムチンX のオープンリーディングフレーム（ORF）の塩基配列を明らかにするため、シーケンスを用いて塩基配列の同定を行った。その結果、ムチンXのORFの約90%を解読したが、残り約10%の配列は繰り返し配列からなるタンデムリピート構造を含んでいることからプライマーが非特異的に結合し、シーケンスを困難にしている。次いでムチンXタンパク質の発現を確認するため、硫酸化糖鎖を発現するように遺伝子改変した細胞株および改変前の細胞株にムチンX遺伝子発現ベクターを遺伝子導入し、細胞破砕液から調製した総タンパク液と細胞培養上清を用いてウェスタンブロットを行った。ムチンXに結合させたタグに対する抗体でウェスタンブロットを行ったところ、総タンパク液から抗タグ抗体で検出されるバンドが確認されたが、タンパク質発現量が低かったことから、実験の条件の変更を行っている。免疫沈降に関しては、条件検討を重ねている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ムチンX遺伝子発現ベクターのシーケンス解析、タンパク質発現解析の進行に遅れが生じたため、令和4年度に実施予定であった免疫沈降は予備実験の段階にあり、成果の取得まで到達していない。遺伝子発現ベクターが有するムチンX遺伝子のORFの塩基配列を同定することは、今後の研究を進めるうえで重要であるが、ムチンX遺伝子にあるタンデムリピート構造がシーケンスを困難にしており、ORF全長の塩基配列を解読できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
ムチンX遺伝子のORFのシーケンスに関しては、さらに複数のプライマーを設計して引き続き、全長解読を試みる。またタンパク質の発現量を高めるため、遺伝子導入条件を変更したうえで解析を進めており、さらには別の遺伝子導入試薬を使用することも検討している。万が一うまくいかない場合には、ムチンX遺伝子発現ベクターを鋳型としてレンチウイルスベクターを作製し、遺伝子導入効率を上げることを考えている。胆管細胞由来の細胞株を用いた実験に関しては、当初の計画通りに進める予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
