| Project/Area Number |
22K06996
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
大森 泰文 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (90323138)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川嵜 洋平 秋田大学, 医学部附属病院, 講師 (00644072)
廣嶋 優子 秋田大学, 医学部附属病院, 助教 (30770044)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | ギャップ結合 / コネキシン / がん幹細胞 / 細胞内輸送 / ストレス応答 |
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| Outline of Research at the Start |
コネキシン(Cx)ファミリーは、細胞膜上でギャップ結合(GJ)を構成するタンパクであり、GJとして腫瘍抑制的に機能する。腫瘍においてGJの機能は減弱しているが、Cxの細胞内への異常局在がその原因の1つであることが知られている。研究代表者らは、ゴルジ体に局在するCxが、腫瘍細胞の増殖や造腫瘍能の亢進、さらにがん幹細胞の自己複製の促進といった「固有の機能」を有していることを明らかにし、ゴルジ体に局在するCxがストレスへの適応応答経路を活性化することで腫瘍細胞の生存を高めることを見出した。本研究においては、腫瘍形成の過程でCxが細胞膜から細胞内、特にゴルジ体に局在を変える分子機構を明らかにしたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和５年度は、以下の点について研究を進めた。
- Rab5やRab9の活性化型変異体によりコネキシン(Cx)のゴルジ体への局在が誘導され、がん幹細胞(CSC)が増加することの証明・・・Rab5やRab9の常時活性化型変異体、Rab5Q79LおよびRab9Q66Lを、細胞膜にギャップ結合を形成する細胞に導入し、Cxの局在がゴルジ体に移行するかどうかを蛍光免疫染色で検討した。材料としては、肝細胞癌や頭頸部扁平上皮癌、乳癌、皮膚扁平上皮癌などの腫瘍由来でCxが細胞膜に局在する細胞を用いた。Cx分子種に関わらず、Rab5Q97Lを導入し高発現させた全ての細胞株で、Cxのエンドサイトーシスが生じ、これらの細胞株のいくつかにおいては、Rab5Q97LとRab9Q66Lを共発現させた際に、Cx26とCx32のゴルジ体への局在が確認された。Cx43に関しては、Rab5Q97Lによるエンドサイトーシスは観察されたが、Rab9Q66Lとの共発現によるゴルジ体への局在は認められなかった。したがって、Rab5とRab9が協調して細胞膜のCx26とCx32をゴルジ体に局在させることが示された。と同時に、Cx43のエンドソームからゴルジ体への逆行輸送は、Rab9以外の因子も関与していることが明らかになった。また、Rab5Q97LとRab9Q66Lにより細胞膜から逆行輸送されゴルジ体に貯留したCx26やCx32の量が増加した際に、CSCマーカーをFACSで解析したところ、CSCが増加していることが確認された。したがって、Rab5とRab9はCx26とCx32を細胞膜からゴルジ体に逆輸送することで、CSCの割合を高めることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
われわれは、ゴルジ体に局在するコネキシン(Cx)がストレス適応応答を惹起し、この適応応答ががん幹細胞の自己複製を促すことを提唱しているが、最近、適応応答に重要な役割を有するHSP70やHSP40の機能をcurcumin類縁体が阻害し、がん幹細胞の自己複製が促進されるすることを見出した (Suzuki M, 他4名, *Omori Y. FEBS Open Bio, 13:434-446, 2023. *corresponding author)。curcuminの抗腫瘍効果は広く知られていることから、Cxの異常局在により惹起されたストレス適応応答が腫瘍進展抑制の標的になることを示すことができた。また、Cxの細胞膜からのエンドサイトーシスのメカニズムが少しずつ明らかになってきたことから、ノルウェーのグループと共に、総説を発表した（Totland MZ, Omori Y,他5名. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 1869:166812, 2023）。
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| Strategy for Future Research Activity |
- コネキシン(Cx)のゴルジ体への逆行輸送に関与するRab5やRab9のエフェクターを同定する・・・Rab5やRab9の直接的な作用で機能が増強するタンパクは「エフェクター」と呼ばれ、Rabファミリーの機能の方向性を決定している。Rab5にはEEAなどの、Rab9にはTIP47などのエフェクターが知られているが、どのエフェクターがCxのゴルジ体への局在をサポートしているのか、エフェクターとされるタンパクの発現を様々な細胞で調べ、これらの発現とCxの局在およびCxの分子種を対応させる。この結果からCxのゴルジ体への局在に関与することが予想されるエフェクターを、shRNAベクターもしくはsiRNAによりノックダウンし、Cxのゴルジ体への局在が解除されるかどうかを検討する。
- Rin3やDENND2をノックアウトし、Cxが細胞膜でギャップ結合(GJ)を形成するかどうか、その際にがん幹細胞画分が減少するかどうか、造腫瘍能が低下するかどうかを検討する・・・Cxがゴルジ体に局在している細胞において、Rab5のguanine-nucleotide exchange factor (GEF)であるRin3と、Rab9のGEFであるDENND2の発現が高まっている。そこで、CRISPR-Cas9の系でゲノム編集を施行し、Rin3ノックアウト細胞とDENND2ノックアウト細胞を作製する。この細胞でCxの局在がゴルジ体から細胞膜に変化し、細胞膜にGJを形成できるようになるかどうかを調べる。また、この際に、がん幹細胞画分が減少するかどうか、マウスにおける造腫瘍能が低下するかどうかを検討する。
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