| Project/Area Number |
22K07072
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49050:Bacteriology-related
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
老沼 研一 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (20635619)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 緑膿菌 / クオラムセンシング / アシルホモセリンラクトンレセプター / RhlR / QscR / 分子機能解析 |
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| Outline of Research at the Start |
日和見感染菌として重要な緑膿菌は、自身の病原性をクオラムセンシング(QS)と名付けられた細胞間情報伝達機構により制御している。本研究では、QSの発動を司るRhlRと抑制因子であるQscRが、いかにそのアクセルおよびブレーキとしての機能を発揮するかを、分子生物学的手法と生化学的手法により明らかにする。これにより、緑膿菌QSの理解を大きく前進させ、病原性抑制薬の開発に繋げることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、緑膿菌に対する病原性抑制薬の開発に向け、本菌のクオラムセンシング（QS）においてアシルホモセリンラクトン（AHL）レセプターとして機能するRhlRとQscRの作用機序の解析を進めている。以下に各課題に関する研究実績の概要を記述する。
1. RhlRの分子機能の解明
RhlRは極度に不安定であり、容易に凝集して失活する性質を持つ。本研究の目的は、活性を保持し、安定で単離精製が可能な改変型RhlRを最小限の変異導入により作出し、その分子機能を明らかにすることである。これまでに、G5K, G6D, L9D, G13D, P20Rの5種類の変異体（数字はアミノ酸番号を、その前後のアルファベットは、それぞれ置換前後のアミノ酸残基を一文字表記で示している）の可溶性を大腸菌発現系を用いて検討し、G6DとL9Dの両変異に可溶性を高める効果があることを発見した。今回、安定性を高める効果がより高い変異を特定すべく、G5D, G5E, G5R, G6E, G6K, G6R, L9E, L9K, L9R, G13E, G13K, G13Rの12種類の変異体の発現ベクターを新たに作製した。現在、これらの変異体の可溶性の確認作業に取り組んでいる。
2. QscRの作用機序の解明に向けたPA1895-1897の機能解析
QscRはQSの発動を抑制する働きを示すが、その作用はPA1895, PA1896, PA1897の3遺伝子（PA1895-1897）の働きを介して生じることが判明している。本研究代表者はPA1895-1897がコードしているのはAHLを分解または修飾する酵素（ここでは単に「AHL分解酵素」と称する）であると推察している。前回、緑膿菌の無細胞抽出液に、QscRとPA1895-1897に依存的なAHL分解活性が検出されたことを報告した。しかし、その後さらに検討を重ねた結果、両欠損株とも一定程度の酵素活性を保持していることが確認された。このことから、AHL分解酵素の正体がPA1895-1897ではない可能性、あるいはPA1895-1897以外に第二の酵素が存在する可能性があるものと推察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RhlRの研究では、これまでにN末端付近のαヘリックス内に存在するアミノ酸残基がRhlRの凝集しやすさに寄与していること、また、それらを親水性のアミノ酸残基に置換することにより、RhlRの安定性を改善できることが確認されている。今回は、より可溶性の高い変異体を見出すべく、12種類の変異体の発現ベクターを新たに構築した。QscRの作用機序の解析では、緑膿菌の細胞にQscRとPA1895-1897に依存的なAHL分解活性があることを確認することができている。qscRとPA1895-1897の欠損株にも一定程度の酵素活性が認められたことは想定外であったが、これも新たな発見につながり得る重要なデータであると捉えている。いずれの課題も計画の進行はやや遅れているが、これは個々の実験作業に手間取ったこと、あるいは予想外の発見があったことによるものであり、大枠としては想定通りに進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. RhlRの分子機能の解明
令和6年度は、上述の12種類の変異体を実際に大腸菌で発現させ、各変異が可溶性に及ぼす影響を検討する。その後、効果が見られた変異を組み合わせ、RhlRの更なる安定化を試みる。次に、得られた変異RhlRのうち最も高い可溶性・安定性を示すものを用いて、分子機能解析（AHLや標的DNAとの解離定数の決定、AHL結合時・非結合時の安定性、二量体形成能、DNA結合活性の比較・解析など）を実施する。これにより、RhlRの諸性質を明らかにし、論文として発表する。
2. QscRの作用機序の解明に向けたPA1895-1897の機能解析
令和6年度は、緑膿菌の無細胞抽出液中に確認されたAHLの分解活性因子の解析を進め、その正体の特定を試みる。また、当初の計画通りPA1895-1897のそれぞれを、タグを付加して緑膿菌細胞内で発現後、精製単離する。これらPA1895-1897の発現産物がAHL分解活性を示すかを確認し、もし活性が検出された場合は、反応産物をLC-MS/MS、NMR等により同定する。これらの実験により、PA1895-1897の分子機能を解明し、QscRによるQS抑制機序を明らかにする。
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