Study for the host recognition mechanism of bacteriophage tail adsorption molecules in Clostridioides difficile

• Project/Area Number: 22K07074
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49050:Bacteriology-related
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 阪口 義彦 北里大学, 医学部, 講師 (70403491)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 和義 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (20626593) ; 武 晃 北里大学, 医学部, 助教 (30818399) ; 大宮 直木 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00335035)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: Clostridioides difficile / C. difficile感染症 / バクテリオファージ / 宿主特異性 / 尾部吸着分子 / 腸内細菌叢 / 治療 / 予防 / 宿主認識機構

Outline of Research at the Start

本研究課題では、ファージ尾部吸着分子をコードする遺伝子群の情報を基に、個々の遺伝子産物を発現・精製し、Clostridioides difficileに対する結合性を調べる。また、本分子の三次元構造解析により、C. difficileへの結合に重要な活性部位を明らかにする。次に、尾部吸着分子のC. difficileレセプター分子を同定し、ファージの宿主認識機構を解明する。得られた情報を基に、C. difficileに得意的なファージをスクリーニングし、CDI発症マウスモデルを用いたin vivo評価を行う。一連の結果を踏まえ、腸内微生物叢を撹乱しない新規CDI治療法の開発に発展させる。

Outline of Annual Research Achievements

Clostridioides (Clostridium) difficile感染症（CDI）は、C. difficileが原因で発症する難治性の下痢症・腸炎である。その治療には抗菌薬が使用されるが、正常な腸内細菌叢の乱れによりCDIの再発を繰り返すことがある。従って、原因となるC. difficileのみを特異的に殺菌する新規治療法の確立が急務である。研究代表者らは、その治療候補の1つとしてバクテリオファージ（ファージ）に着目した。ファージは、自然界に普遍的に存在しており、宿主となる細菌に特異的に結合し殺菌活性を示す。本研究課題では、ファージの特性を利用したCDIの新規治療法の確立を目指し研究開発を行っている。本年度においては、ファージの宿主認識分子（尾部吸着分子）と推定した2つの遺伝子産物（Hisタグ融合ORFA、Hisタグ融合ORFB）のC. difficile リボタイプ027株に対する結合性について、enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) の条件検討を行った。一次抗体にHisタグ抗体を用いたELISAによる検出法では、非特異的な検出が認められた。そこで、精製His融合ORFAまたはHis融合ORFBを直接horseradish peroxidase（HRP）で標識し、C. difficileに対する結合性を調べたところ、時間依存的および濃度依存的に結合することが明らかとなった。現在、他のリボタイプ株に対する結合性について解析を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題では、まず、精製した2つの組換えタンパク質（Hisタグ融合ORFA、Hisタグ融合ORFB）のClostridioides difficileに対する結合性について、ORFAまたはORFBに対する抗体を用いたenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) により評価する予定にしていた。本検出の中で、ORFAまたはORFBに対する抗体の作製には時間を要することから、ELISAでの検出に一次抗体としてHisタグ抗体を用いて検出することにした。しかしながら、Hisタグ抗体を用いることで、特異的な結合のみを検出することが困難であった。そこで、ORFAまたはORFBに直接horseradish peroxidase（HRP）標識することで、C. difficileに対する結合性を検出することにした。その結果、作製したHRP標識ORFAまたはORFBを用いることで、時間依存的および濃度依存的なC. difficileへの結合が認められた。現在、他のリボタイプに対する結合性についても調べている。

Strategy for Future Research Activity

研究代表者が単離したバクテリオファージ（ファージ）のClostridioide difficile に対する結合は、ファージのゲノム情報からORFAおよびORFBを含む数種のタンパク質（尾部吸着分子）が機能している可能性を考えた。そこで、ORFAおよびORFB以外のタンパク質を作製することが必要となった。本作製において、中型恒温振とう培養機を用いることで効率よく種々の組換えタンパク質を発現することが可能となる。発現したタンパク質のC. difficile に対する結合性を調べる。
1）推定した吸着分子をコードする遺伝子を人工遺伝子合成し、これを発現用ベクターに挿入する（プラスミド構築）。
2）本プラスミドを大腸菌発現系により組換えタンパク質（Hisタグ融合タンパク質）として発現させ、コバルトアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
3）作製したHisタグ融合タンパク質のC. difficileに対する結合をEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) およびウエスタンブロット法により解析し、C. difficileに対する吸着分子の特異性を明らかにする。ウエスタンブロット法においては、画像解析装置一式を用いて作製した種々の吸着分子のC. difficileへの結合性を評価する。

Research Products

• [Journal Article] Lysyl oxidase-like 4 exerts an atypical role in breast cancer progression that is dependent on the enzymatic activity that targets the cell-surface annexin A2 (2023)
  • Author(s): Sakaguchi, M., Komalasari, N. L. G. Y., Tomonobu, N., Kinoshita, R., Chen, Y., Sakaguchi, Y., Gohara, Y., Jiang, F., Yamamoto, K., Murata, H., Ruma, I. M. W., Sumardika, I. W., Zhou, J., Yamauchi, A., Kuribayashi, F., Inoue, Y., Toyooka, S.
  • Journal Title: Front. Oncol. Volume: 13 Pages: 1142907-1142907
  • DOI: 10.3389/fonc.2023.1142907
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Impact of body composition for patients with hepatocellular carcinoma who received atezolizumab plus bevacizumab therapy (2023)
  • Author(s): Uojima, H., Chuma, M., Hidaka, H., Tsuda, T., Kobayashi, S., Hattori, N., Ogushi, K., Arase, Y., Take, A, Sakaguchi, Y., Ando, T., Nishigori, S., Watanbe, T., Numata, K., Morimoto, M., Kagawa, T., Kako, M., Kusano, C.
  • Journal Title: Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. Volume: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fecal microbiota transplantation as therapy for recurrent Clostridioides difficile infection is associated with amelioration of delirium and accompanied by changes in fecal microbiota and the metabolome (2022)
  • Author(s): Gotoh Kazuyoshi、Sakaguchi Yoshihiko、Kato Haru、Osaki Hayato、Jodai Yasutaka、Wakuda Mitsutaka、Take Akira、Hayashi Shunji、Morita Eri、Sugie Takehiko、Ito Yoichiro、Ohmiya Naoki
  • Journal Title: Anaerobe Volume: 73 Pages: 102502-102502
  • DOI: 10.1016/j.anaerobe.2021.102502
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Evaluation of skeletal muscle mass in patients with chronic liver disease shows different results based on bioelectric impedance analysis and computed tomography (2022)
  • Author(s): Kikuchi, N., Uojima, H., Hidaka, H., Iwasaki, S., Wada, N., Kubota, K., Nakazawa, T., Shibuya, A., Kako, M., Take, A., Sakaguchi, Y., Sato, T., Kusano, C.
  • Journal Title: Ann. Nutr. Metab. Volume: 78(6) Issue: 6 Pages: 336-344
  • DOI: 10.1159/000526563
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phylogenic analysis of new viral cluster of large phages with unusual DNA genomes containing uracil in place of thymine in gene-sharing network, using phages S6 and PBS1 and relevant uncultured phages derived from sewage metagenomics (2022)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Gotoh, K., Kato, S., Sakaguchi, Y., Murakami, H., Fukuyama, T., Kaneki, M., Matsushita, O., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: Virus Res. Volume: 319 Pages: 198881-198881
  • DOI: 10.1016/j.virusres.2022.198881
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The change rate in serum nitric oxide may affect lenvatinib therapy in hepatocellular carcinoma. (2022)
  • Author(s): Kawamura A, Uojima H, Chuma M, Shao X, Hidaka H, Nakazawa T, Take A, Sakaguchi Y, Numata K, Kako M, Nozaki A, Azuma S, Horio K, Kusano C, Atsuda K
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 22 Issue: 1 Pages: 912-921
  • DOI: 10.1186/s12885-022-10002-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Antibiotic-resistant status and pathogenic clonal complex of canine Streptococcus canis-associated deep pyoderma (2022)
  • Author(s): Imanishi, I., Iyori, K., Take, A., Asahina, R., Tsunoi, M., Hirano, R., Uchiyama, J., Toyoda, Y., Sakaguchi, Y., Hayashi, S.
  • Journal Title: BMC Vet. Res. Volume: 18(1) Issue: 1 Pages: 395-395
  • DOI: 10.1186/s12917-022-03482-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] C型とD型ボツリヌス毒素をコードするバクテリオファージのゲノム比較解析 (2023)
  • Author(s): 阪口義彦、武 晃、後藤和義、山本由弥子、幸田知子、向本雅郁、小崎俊司、林 俊治、林 哲也、小熊惠二
  • Organizer: 第96回日本細菌学会総会
  • Invited
• [Presentation] ヒト糞便検体からの放線菌の分離とその生物活性評価 (2023)
  • Author(s): 武 晃、阪口義彦、菊池雄太、稲橋佑起、後藤和義、林 俊治、坂本光央、大宮直木
  • Organizer: 第96回日本細菌学会総会
• [Presentation] チミンの代わりにウラシルを含む珍しいゲノムDNAを有するジャイアントファージ群の系統的位置付け (2022)
  • Author(s): 内山淳平、竹村伊代、後藤和義、加藤伸一郎、阪口義彦、村上裕信、福山朋季、金木真央、松下治、松崎茂展
  • Organizer: 第10回ファージ研究会
• [Presentation] ヒト糞便検体からの放線菌の分離とその代謝産物解析 (2022)
  • Author(s): 武 晃、阪口義彦、菊池雄太、稲橋佑起、後藤和義、坂本光央、林 俊治
  • Organizer: 2022年度（第36回）日本放線菌学会大会
• [Presentation] チミンの代替えにウラシルを使用したDNAゲノムを有する巨大ブドウ球菌ファージS6を利用した関連ファージ群の系統分類 (2022)
  • Author(s): 内山淳平、内山伊代、後藤和義、加藤伸一郎、阪口義彦、村上裕信、福山朋季、金木真央、松下治、松崎茂展
  • Organizer: 第66回日本ブドウ球菌研究会