「重力ゲートウェイ反射」を制御する神経回路の解明と操作技術の開発

• Project/Area Number: 22K07112
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49070:Immunology-related
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences
• Principal Investigator: 山崎 剛士 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 助教 (70709881)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: ゲートウェイ反射 / 神経回路 / アデノ随伴ウイルスベクター / 血管ゲート / 交感神経 / 感覚神経 / 神経免疫 / ニューロモデュレーション

Outline of Research at the Start

神経系と免疫系の機能連関が様々な慢性炎症性疾患の病態形成に関与する。本研究室では、免疫性神経疾患の一つである多発性硬化症モデルマウスを用いて、重力を起点とする神経回路活性化によって、中枢神経組織への免疫細胞の侵入口「血管ゲート」が形成され、浸潤した自己反応性T細胞により第5腰髄で病態が誘導される「重力ゲートウェイ反射」を発見した。本研究課題では、重力ゲートウェイ反射における血管ゲート形成に関与する神経回路を解明し、ウイルスベクターを用いた重力ゲートウェイ反射制御のための新規ニューロモデュレーション技術を樹立する。

Outline of Annual Research Achievements

神経系と免疫系の機能連関が様々な慢性炎症性疾患の病態形成に関与する。本研究室では、免疫性神経疾患である多発性硬化症のモデルマウスを用いて、重力を起点とする神経回路活性化により中枢神経組織への免疫細胞の侵入口「血管ゲート」が形成され、浸潤した自己反応性T細胞によって第5腰髄で病態が誘導される「重力ゲートウェイ反射」を発見した。本研究課題では、重力ゲートウェイ反射における血管ゲート形成に関与する神経回路の詳細を明らかにするため、第5腰椎 (L5) 後根神経節 (DRG) 感覚神経の投射を受けるニューロン、L5背側血管ゲートに投射する交感神経を解剖学レベル・分子生物学レベルで同定することを目的とした。
2022年度は、抗重力筋であるヒラメ筋に投射するL5 DRG感覚神経とL5背側血管ゲートに投射する交感神経の間の神経接続を探索した。Cre recombinase依存的に赤色蛍光タンパクを発現するAi14マウスと、神経細胞特異的にCreを発現するアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV) を用いて、標的神経をジェネティックに蛍光標識することを試みた。標的神経細胞から一度だけシナプスを乗り越えて後シナプス神経に遺伝子導入できる血清型rAAV1をAi14マウスのヒラメ筋に接種したところ、L5 DRG神経に加え、L5交感神経幹の神経細胞も蛍光標識された。この結果は、ヒラメ筋に投射する感覚神経とL5交感神経が経シナプス接続している、もしくはL5交感神経がヒラメ筋に直接投射している可能性を示唆している。
次に、逆行性に軸索輸送され、投射元の神経細胞に遺伝子導入可能なrAAV-retroを静脈投与し、血管ゲート形成部に投射する神経細胞の標識を試みた。組織透明化法にて広範に解析したところ、L5背側血管近傍に投射する神経が標識されたことから、L5背側血管を中心に血管ゲートが形成されていることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題では、重力ゲートウェイ反射における血管ゲート形成に関与する神経回路を明らかにするため、rAAVとトランスジェニックマウスを用いて標的神経をジェネティックに標識し、組織透明化技術と組み合わせて広範かつ効率的な神経回路の検索を行うこと、また、ケモジェネティクス法とオプトジェネティクス法を用いて当該神経細胞の活動に介入し血管ゲート形成への関与を検証することを計画している。具体的には、①L5 DRG感覚神経の投射を受けるニューロンの同定 ②L5背側血管ゲートに投射するニューロンの同定 ③scRNA-seqによる神経細胞種の同定 ④血管ゲート形成への関与の検証を計画していた。2022年度は計画通り、L5 DRG感覚神経とL5交感神経間の神経接続の解析が進んだ。また、同定には達していないものの、L5背側血管ゲートに投射する神経の標識に成功した。神経活動への介入による血管ゲートの操作技術に関しては、チロシンヒドロキシラーゼ (TH) プロモーター依存的にCreを発現するrAAVとCre依存的に神経細胞でDREADDを発現するrAAVを脳室傍核に接種し、TH陽性神経細胞の活性をケモジェネティクス法で制御することで、血管ゲートを形成することに成功しており、今後、重力ゲートウェイ反射における血管ゲート形成制御への応用が期待できる。
以上の進捗より、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、ヒラメ筋に投射しているL5 DRG感覚神経とL5 交感神経間の神経ネットワークの詳細を明らかにする。具体的には、経シナプス伝播してCreを発現するrAAV1をAi14マウスのL5 DRGに接種することで、L5 DRG感覚神経が投射する神経細胞を蛍光標識する。また、L5背側血管に投射する神経細胞の同定のため、THプロモーター依存的にCreを発現するrAAV-retroをAi14マウスに静脈投与し、血管ゲート形成部に投射するノルアドレナリン作動性ニューロンを標識する。いずれの場合も、組織透明化法を用いて広範に標識神経細胞を探索する。標識神経細胞を同定した後は、sc-RNAseqにより標識神経細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、特異的マーカー遺伝子の探索を行う。
上記の手法により同定された神経細胞の神経核・神経節に、特異的マーカー遺伝子のプロモーター下で抑制性のDREADDを発現するrAAVを接種する。ケモジェネティクス法による慢性的な神経活動抑制条件下にて、自己反応性T細胞を静脈投与し、血管ゲートを介した免疫細胞の浸潤、症状、病態形成への影響を評価する。また、同定された神経回路が抑制性ニューロンを介している場合には、抑制性の投射を受ける神経細胞にチャネルロドプシンを発現させ、オプトジェネティクス法により神経刺激した場合の影響を評価する。以上の方法を用いて血管ゲート形成を制御する技術基盤を構築したい。