自然免疫型T細胞分化を担う核内リン酸化酵素の基質同定と転写プログラム誘導機構

• Project/Area Number: 22K07117
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49070:Immunology-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 石川 絵里 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (20546478)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 自然免疫型T細胞分化 / 転写プログラム / セリンスレオニンキナーゼ / 自然免疫型T細胞

Outline of Research at the Start

我々は通常のT細胞は正常であるが、自然免疫型T細胞のみが消失するシグナル分子欠損マウスを見出した。また、当該シグナル分子の基質として、リンパ球分化に寄与することが知られている転写因子を同定し、さらにこの転写因子の結合モチーフが自然免疫型T細胞分化に必須の転写因子PLZFの上流に存在することを見出した。
本研究では、基質分子のPLZF転写制御における役割、またリン酸化の意義を調べることにより、当該シグナル分子からPLZF発現誘導に至る分子機構を明らかにし、自然免疫T細胞分化を担う新たなシグナル経路の同定を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

自然免疫型T細胞に属するインバリアントナチュラルキラーT (iNKT) 細胞や粘膜関連インバリアントT (MAIT) 細胞の胸腺での分化機構は、従来のT細胞に比べ未だ不明な点が多い。また、自然免疫T細胞の分化には転写因子PLZFが必須であるが、T細胞受容体からPLZF発現に至る分子機構の詳細は明らかになっていない。これまでの研究により、プロテインキナーゼD (PKD)のT細胞特異的欠損マウスで、自然免疫T細胞が消失することを見出した。この消失はPLZF Tgの導入により回復し、PKDがPLZFの発現誘導に寄与することが示唆された。本研究では、自然免疫T細胞が特異的に消失するユニークなPKD欠損マウスを用い、PKDの基質分子を同定し、リン酸化の意義を明らかにすることで、自然免疫T細胞分化に至る転写プログラムの誘導機構を明らかにすることを目的としている。
これまでに、PKDはiNKT細胞においてTCR刺激により活性化することを見出している。また、iNKT細胞でのPKD基質として転写因子を同定済みであり、昨年度の研究において、当該基質がiNKT細胞で特異的に制御する可能性のある遺伝子をクロマチン免疫沈降ChIP-seqにより解析したところ、PLZF遺伝子上流への結合が認められた。また、ChIP-qPCRおよびルシフェラーゼアッセイでも、PLZFの転写制御に寄与することを示唆する結果を得た。そこで今年度は、当該転写因子の結合モチーフを欠損させたPLZF遺伝子プロモーターを用いてルシフェラーゼアッセイを行なったところ、転写活性の低下が認められた。また、当該基質のPKDによりリン酸化されるセリン残基をアラニンに置換したリン酸化不能型変異体ノックインマウスを樹立し、解析を行なった。その結果、PKDによるリン酸化がiNKT細胞分化に寄与する可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度のChIP-seqにより、iNKT細胞におけるPKD基質として同定した転写因子がiNKT細胞分化のマスター転写因子PLZF遺伝子の上流に結合することを見出した。またルシフェラーゼアッセイでも、PLZFの転写制御に寄与する結果を得た。今年度は当該基質結合モチーフを欠損させたPLZF遺伝子プロモーターを用いてルシフェラーゼアッセイを行い、転写活性の低下を認めたことから、当該基質はPLZF遺伝子上流に結合し、転写制御に働くことが強く示唆された。また現在、結合モチーフを欠損させたマウスの作成も進めている。
リン酸化プロテオミクスおよびin vitro キナーゼアッセイにより、当該基質のPKDによるリン酸化部位はすでに同定済みであり、これまでにリン酸化されるセリンをアラニンに置換したリン酸化不能型変異体ノックインマウスを樹立し、本マウスではiNKT細胞数が野生型マウスの半分程度に減少していることを明らかとなり、PKDによるリン酸化がiNKT細胞分化に重要であることが示唆された。PKD欠損マウスでは自然免疫型T細胞のMAIT細胞もほぼ消失しており、その分化にもPLZFが重要な役割を果たす。そこで、本ノックインマウスにおけるMAIT細胞への影響を調べたところ、成体マウスを解析した限りでは野生型マウスと差は見られなかった。
また、当該基質のリン酸化がPLZF転写制御に与える影響を調べるため、リン酸化不能型変異体を導入した細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行ったが、野生型と比較して変化は認められなかった。このことから、PKDによるリン酸化はPLZF遺伝子上流への結合や転写制御そのものではなく、他の転写制御因子との相互作用などに寄与する可能性も考えられた。今年度はPKD基質のリン酸化がiNKT細胞分化に寄与することを生体レベルで示すことができ、研究は概ね順調に進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今年度は、iNKT細胞におけるPKD基質である転写因子が、PLZF遺伝子プロモーター部位に結合し、その転写制御に働くことを強く示唆する結果を得た。このことがiNKT細胞分化、維持に与える影響を生体レベルで検証するため、PLZF遺伝子プロモーター上の当該基質の結合モチーフを欠損させたマウスの作成を進めており、現在樹立できつつある。
PKD基質のリン酸化不能型変異体を導入した細胞を用いたルシフェラーゼアッセイでは、PLZF転写活性の低下は認められなかったが、本PKD基質のリン酸化不能型変異体ノックインマウスでは、iNKT細胞数が野生型マウスの半分程度に減少しており、PKDによるリン酸化は、直接のPLZF転写制御以外の機能を介して、iNKT細胞分化に寄与する可能性も考えられた。まずは、本マウスより採取した細胞を用いたChIP-qPCRにより、PLZF遺伝子上流への結合を野生型と比較する予定である。もし結合に差が見られなかった場合は、当該基質のリン酸化が他の分子との相互作用を介してiNKT細胞分化に寄与する可能性を考え、リン酸化依存的な結合分子の同定を目指す。具体的には、BioID (近位依存性ビオチン化)の技術を用いて、TCR刺激依存的に当該基質に結合する分子をマススペクトル解析により同定したいと考えている。結合分子が同定された場合には、その分子が当該基質の機能に与える影響を検証する予定である。