消化器癌における血中循環腫瘍細胞のクラスター化阻害に着目した新規治療開発

Research Project

Project/Area Number	22K07185
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 50010:Tumor biology-related
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	三輪武史富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (90775800)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	奥村知之富山大学, 学術研究部医学系, 講師 (10533523) 藤井拓人富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50567980) 藤井努富山大学, 学術研究部医学系, 教授 (60566967)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	CTC / α3NaK / 胃癌 / 膵癌 / マウスモデル / 血中循環腫瘍細胞 / Naポンプ / マウスCTCアッセイ / 強心配糖体
Outline of Research at the Start	血中循環腫瘍細胞（CTC）のクラスター化を植物由来の強心配糖体が阻害することが報告された。強心配糖体によるCTCのクラスター化阻害の分子機構の解明を目的とする。フローサイトメトリーを用いることでCTCを生きた細胞のまま検出し抽出し、研究分担者の薬学部藤井によって細胞表面のナトリウムポンプとCTCクラスター化の分子機構解明をすすめる。強心配糖体がCTCクラスター化を阻害する機序を解明することで、治療に使用可能な強心配糖体の抽出や分子構造の特定が可能となり、臨床応用できるようになる。
Outline of Annual Research Achievements	これまで大腸癌、肝細胞癌、胃癌細胞株を用いた細胞株レベルでのα3NaKの発現と、アノイキス回避におけるα3NaKの機能について検証してきた。癌細胞の遊離（Detach）操作の際のα3NaKの原形質膜への移行が重要な役割を果たしていると考え、まずは膵癌細胞株の通常のAttach状態とDetach状態を再現し、そのα3NaKの発現を確認した。細胞表面ビオチン化を行い、膵癌細胞株であるPanc1とMIAPaca2を使用して原形質膜のα3NaK発現を比較し、Attach状態ではPanc1とMIAPaca2どちらも、α3NaKの発現認めず、Detach状態ではα3NaKが細胞表面の原形質膜へ移動していることが確認できた。さらに免疫染色でのα3NaKの局在変化について確認した。MIAPaca2を使用してα3NaKを蛍光抗体で染色したところ、Attach状態の膵癌細胞株では主に、細胞質内、核の周囲にα3NaKは分布しており、Detach状態にした細胞では原形質膜（細胞表面）にドット状に分布を認めた。マウスCTCモデル作成においては、ヌードマウスにMIAPaca2を使用して皮下腫瘍を作成し、6～8週間後に心臓採血を行うモデルを作成した。マウス血を溶血処理し、抗マウスCD45抗体を用いてマウス細胞をネガティブセレクションすることでCTCを濃縮モデルを確立。腫瘍生着率75%、CTC採取率43%の精度でCTCを回収し得た。マウスモデルより回収したCTCに対して、α3NaKの発現を確認し、蛍光抗体法にて原形質膜にドット状に分布することを確認、Detach状態として矛盾ない結果を確認した。今後、強心配糖体作用下でのα3NaK発現について検証する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CTCマウスモデルでのCTC確認は許容できる精度で作成できている。強心配糖体作用下でのチャネル局在変化について検証を始めている。
Strategy for Future Research Activity	強心配糖体によるα3NaK分布の変化を検証し、CTCの遊離接着おける作用を検証する。これにより、癌細胞が生存したまま循環する機序の解明につなげる。