神経芽腫の時期・細胞特異的な発生機構解明

• Project/Area Number: 22K07186
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 坪田 庄真 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (10801657)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 神経芽腫 / スフェア / MYCN / シングルセル解析

Outline of Research at the Start

小児がんの一つである神経芽腫は、様々なゲノム異常とエピゲノム異常が混在し、治療抵抗性から自然退縮まで表現型が極めて多様である。しかし、そもそもなぜ神経芽腫が発生するのか、特にがん化の時期や細胞特異性、神経芽腫を成り立たせる因子（発生に必須の遺伝子）については不明である。本研究では、独自の培養技術とシングルセル遺伝子発現解析の結果を活用し、マウス副腎組織を対象とした各種細胞タイプの選別、in vitroでのがん化誘導による神経芽腫の起源となる細胞（がん化する細胞タイプ）の同定、網羅的な遺伝子発現解析や介入実験を行い、神経芽腫の時期や細胞特異性に着目した発生機構の解明を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は独自の細胞培養系（in vitro神経芽腫発生モデル）を用いて神経芽腫のがん化に時期特異性が存在するという予備データを得た。本研究は時期や細胞特異性に着目した神経芽腫の発生機構の解明を目的とし、将来的な新規治療法の開発に資する基盤を構築することを目指している。具体的には、（実験1）生後0日マウス副腎組織中に存在しがん遺伝子MYCNにより形質転換する細胞タイプの同定、（実験2）がん化細胞タイプの週齢別での存在確認、（実験3）がん化細胞タイプの週齢別の選別と遺伝子発現解析、（実験4）時期特異性を担う遺伝子の同定という実験項目について研究を進めている。昨年度、実験1について細胞表面抗原に対する抗体を用いた細胞選別を試したが、良い抗体がなく実験のセッティングに幾つか問題点が生じ、抗体を用いた細胞選別という方法は難しいと考えた。実験２については既に知られている神経芽腫の起源と推定されている副腎組織中の細胞タイプについて週齢別の存在をRNA-ISHで評価した。今年度は、当初の研究計画を変更し、各週齢のマウス副腎組織（0週、1週、2週、3週齢）と0週齢の副腎組織由来細胞をMYCNにより形質転換したスフェアを対象にシングルセル遺伝子発現解析を行った。時期特異的に消失する細胞タイプの存在を確認し、またMYCNにより形質転換したスフェア細胞の特徴付けを行った。さらに、レポーターマウスを用いた細胞単離と形質転換実験を組み合わせることで、概ねMYCNにより形質転換する細胞タイプの絞り込みができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度から少々遅れているが、実験1で当初予定していた表面抗原マーカーを用いた細胞選別で、想定通りに実験を遂行できなかった。その代案として、今年度はマウス副腎組織（0週、1週、2週、3週齢）と0週齢のマウス副腎組織由来細胞をMYCNにより形質転換したスフェアを対象にシングルセル遺伝子発現解析を行った。副腎組織の週齢別の比較によって、神経芽腫の起源細胞だと推測されている神経芽細胞は週齢が経つにつれて消失していくことが分かった。これについては昨年度に実施したRNA-ISHの結果と合致した。一方で、MYCNにより形質転換したスフェアの遺伝子発現を副腎組織と比較することで、MYCNにより形質転換した起源となる細胞の候補を明らかにした。これまで知られていたようにチロシン水酸化酵素（Th）を発現していることが分かった。またTh-EGFPレポーターマウスを用いた細胞選別によりMYCNにより形質転換する細胞はTh陽性細胞であることが明らかとなった。興味深いことに、この細胞タイプは神経芽細胞の特徴よりもクロム親和性細胞の特徴を持つということが明らかとなった。神経芽腫は神経芽細胞由来だと考えられていたが、クロム親和性細胞である可能性も出てきた。

Strategy for Future Research Activity

当初予定していた実験１から３については概ね良好な結果を得ることができたが、神経芽腫の起源が神経芽細胞なのかクロム親和性細胞なのか新たな疑問が生じてしまう結果となった。これについてシングルセル遺伝子発現解析結果の精査を行うとともに、神経芽細胞もしくはクロム親和性細胞を特異的に分取できる新たなレポーターマウスの導入を検討する。さらにシングルセル遺伝子発現解析を引き続き行い、細胞や時期特異性についてMYCNと強調的に働くと考えられる遺伝子について同定を試みる。