難治性乳がんに対する変異p53依存的悪性化・転移機構に対する分子基盤の解明

• Project/Area Number: 22K07205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 中山 哲俊 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (10835226)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 知明 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50447299)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
• Keywords: 変異ｐ53 / メバロン酸合成経路 / がん悪性化形質 / 難治性乳がん

Outline of Research at the Start

治治療抵抗性乳がんや再発・転移を繰り返す難治性乳がんに対するゲノムワイドのクリニカルシークエンスが盛んに行われている中、変異p53が獲得する多面的機能が、”MalignantDriver”として積極的ながん悪性化に作用する知見が再注目されている。本研究では、変異p53のもたらす"gain of function"がメバロン酸合成経路に対しどのようなメカニズムで影響を与え悪性形質をもたらすのか、その悪性形質をもたらす直接的な下流標的分子が何であるかを明らかにすることを目指す。この成果により、「変異p53を持つ難治性乳がん」を標的とした新たな治療法の開発や創薬シーズの提案に繋がることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

変異p53による乳がん悪性化機構に、鍵分子を介したメバロン酸合成経路によるSmall G タンパク質の活性化とそれによりもたらされるフィロポディアの関与が示唆された事から、今年度はまず異なるp53ステータスを持つMDA-MB-231乳がん細胞株に対して、生細胞でアクチン繊維を可視化することが出来るLifeact-GFP発現細胞株を作成しIn vivoでの検討を行った。その結果、変異p53はIn vivoにおいても増殖・転移と関連が認められ、In vitroと同様にIn vivoでも変異p53存在下でフィロポディア様の形態を確認することができた。このことから変異p53とフィロポディア、悪性形質の関連を明らかにすることができた。また、scRNA-seq解析を更に進めたところ、特定のクラスターが悪性形態に関与していることが示唆された。更に、Small G タンパク質、特にRAC1、CDC42に関して活性化フォームであるGTPフォームを確認したところ、悪性形態でGTPフォームが増加していることを確認した。また、ノンターゲットプロテオミクスの解析も更に進め、遺伝子発現以外の観点からSmall Gタンパク質の下流で悪性形質をもたらす分子群の同定を行った。その結果いくつかの分子が同定され、その中でLLGL scribble cell polarity complex component 2(LLGL2)に着目し現在検討を行っている。まず、LLGL2ノックアウト細胞株を作成し検討を行ったところ、悪性形質の抑制を確認した。以上から変異p53は鍵分子を介してメバロン酸合成経路を活性化しSmall G タンパク質を活性化しLLGL2を制御し乳がんの悪性化をもたらしている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一連の研究で現在までに新規に見出した鍵分子が変異p53とメバロン酸合成経路を繋ぎ、変異p53による乳がん悪性化の重要なファクターになるという発見に至っている。更にその分子機構として、Small G タンパク質を介したフィロポディアの関与が示唆された。それらを更に強固にする知見としてLifeact-GFP発現細胞株を作成し、それによりIn vivoでの変異p53とフィロポディアの関係性を確認することが出来た。また、悪性形質ではSmall G タンパク質が活性化されていることも確認でき、更にその下流の因子としてLLGL2を見出した。LLGL2の発現が鍵分子とSREBP2をそれぞれノックアウトしたMDA-MB-231細胞株で大幅に減少していることを確認している。このことから鍵分子、SREBP2を介したメバロン酸合成経路によってLLGL2が制御されていることが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

scRNA-seqを用いた今回の検討で悪性形態に関与している特定のクラスターを見出したが、このクラスターに関して更なる解析を進める。特にGene Ontology解析などを用いることでFilopodiaやMigrationに関係する遺伝子やPathwayが関与しているかを検討する。更に、見つかった遺伝子をノックアウトし悪性形態が抑制されるのかを検討することでクラスターと悪性形質との関連を確認する。また、変異p53による鍵分子の制御機構に関してChIP assayを行って結合を確認しているが、ChIP-seqを行い変異p53と鍵分子の関係性をより明確にする予定である。更に、今回明らかになったLLGL2に関して更なる解析を進める。特にLLGL2とSmall G タンパク質との関わりを確認すると共に、LLGL2ノックアウト細胞を用いてIn vivoでの増殖・転移・悪性形態がどのように変化するか検討を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Identification of genotype?biochemical phenotype correlations associated with fructose 1,6-bisphosphatase deficiency (2023)
  • Author(s): Sakuma Ikki、Nagano Hidekazu、Hashimoto Naoko、Fujimoto Masanori、Nakayama Akitoshi、Fuchigami Takahiro、Taki Yuki、Matsuda Tatsuma、Akamine Hiroyuki、Kono Satomi、Kono Takashi、Yokoyama Masataka、Nishimura Motoi、Yokote Koutaro、Ogasawara Tatsuki、Fujii Yoichi、Ogawa Seishi、Lee Eunyoung、Miki Takashi、Tanaka Tomoaki
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 6 Issue: 1 Pages: 787-787
  • DOI: 10.1038/s42003-023-05160-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Liver group 2 innate lymphoid cells regulate blood glucose levels through IL-13 signaling and suppression of gluconeogenesis (2022)
  • Author(s): Fujimoto Masanori、Yokoyama Masataka、Kiuchi Masahiro、Hosokawa Hiroyuki、Nakayama Akitoshi、Hashimoto Naoko、Sakuma Ikki、Nagano Hidekazu、Yamagata Kazuyuki、Kudo Fujimi、Manabe Ichiro、Lee Eunyoung、Hatano Ryo、Onodera Atsushi、Hirahara Kiyoshi、Yokote Koutaro、Miki Takashi、Nakayama Toshinori、Tanaka Tomoaki
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 1-21
  • DOI: 10.1038/s41467-022-33171-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Proteogenomic landscape and clinical characterization of GH-producing pituitary adenomas/somatotroph pituitary neuroendocrine tumors (2022)
  • Author(s): Yamato A,Nagano H,Gao Y,Matsuda T,Hashimoto N,Nakayama A,Yamagata K,Yokoyama M,Gong Y,Shi X,Zhahara N,Kono T,Taki Y,Furuki N,Nishimura M,Horiguchi K,Iwadate Y,Fukuyo M,Rahmutulla B,Kaneda A,Hasegawa Y,Kawashima Y,Ohara O,Ishikawa T,Kawakami E,Nakamura Y,Inoshita N,Yamada S,Fukuhara N,Nishioka H,Tanaka T
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 5 Issue: 1 Pages: 1304-1304
  • DOI: 10.1038/s42003-022-04272-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MicroRNA-874 targets phosphomevalonate kinase and inhibits cancer cell growth via the mevalonate pathway (2022)
  • Author(s): Aersilan Alimasi、Hashimoto Naoko、Yamagata Kazuyuki、Yokoyama Masataka、Nakayama Akitoshi、Shi Xiaoyan、Nagano Hidekazu、Sakuma Ikki、Nohata Nijiro、Kinoshita Takashi、Seki Naohiko、Rahmutulla Bahityar、Kaneda Atsushi、Zhahara Siti Nurul、Gong Yingbo、Nishimura Motoi、Kawauchi Shoichiro、Kawakami Eiryo、Tanaka Tomoaki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 18443-18443
  • DOI: 10.1038/s41598-022-23205-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] GLS2 Is a Tumor Suppressor and a Regulator of Ferroptosis in Hepatocellular Carcinoma (2022)
  • Author(s): Suzuki Sawako、Venkatesh Divya、Kanda Hiroaki、Nakayama Akitoshi、Hosokawa Hiroyuki、Lee Eunyoung、Miki Takashi、Stockwell Brent R.、Yokote Koutaro、Tanaka Tomoaki、Prives Carol
  • Journal Title: Cancer Research Volume: 82 Issue: 18 Pages: 3209-3222
  • DOI: 10.1158/0008-5472.can-21-3914
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 機能獲得型変異p53によるメバロン酸経路制御と乳がん悪性化機構の解明 (2023)
  • Author(s): 中山 哲俊、 横山 真隆、 永野 秀和、 山形 一行、 橋本 直子、 田中 知明
  • Organizer: 第96回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] メバロン酸経路制御を介した機能獲得型変異p53による乳がん悪性化機構 (2023)
  • Author(s): 中山 哲俊、横山 真隆、宮 英博、石 暁彦、永野 秀和、山形 一行、橋 本 直子、渕上 孝裕、田中 知明
  • Organizer: 第82回日本癌学会学術総会
• [Presentation] microRNA-874はホスホメバロン酸キナーゼを標的としてメバロン 酸経路を介した乳がん細胞の増殖を抑制する (2023)
  • Author(s): 石 暁彦、橋本 直子、山形 一行、横山 真隆、中山 哲俊、関 直 彦、田中 知明
  • Organizer: 第82回日本癌学会学術総会
• [Presentation] シングルセル解析を用いたmiR-874による乳がんの増殖抑制メカニズム (2023)
  • Author(s): 橋本 直子、山形 一行、石 暁彦、藤本 真徳、中山 哲俊、横山 真隆、田中 知明
  • Organizer: 第96回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] Single Cell RNA-seq解析を用いた変異p53“Gain of Function“によるメバロン酸合成経路を介したがん悪性化機構の解明 (2022)
  • Author(s): 中山哲俊、横山真隆、永野秀和、山形一行、橋本直子、村田和貴、樋口誠一郎、清野透、田中知明
  • Organizer: 第95回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] プロテオミクスによるMDM2が制御するフェロトーシスの分子基盤の探索 (2022)
  • Author(s): 古木 直人, 永野 秀和, 中山 哲俊, 藤本 真徳, 横山 真隆, 田中知明
  • Organizer: 第95回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] 非機能性神経下垂体腫瘍における single cell アトラス (2022)
  • Author(s): 高 躍, 松田 達磨, 藤本 真徳, 中山 哲俊, 橋本 直子, 山形 一行, 横山真隆, 堀口健太郎, 岩立康男, 田中知明
  • Organizer: 第23回日本内分泌学会関東甲信越支部学術集会
• [Presentation] Mechanism of Breast Cancer Malignant Transformation via Mevalonate Pathway by Mutant p53 Using Single Cell RNA-seq (2022)
  • Author(s): 中山哲俊、横山真隆、Zhahara Siti N、石暁彦、宮英博、橋本直子、山形一行、田中知明
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 新規p53標的遺伝子lncRNA-1はヒト幹細胞の多能性を失わせDNA損傷に応答した細胞死を阻害する(p53-inducible lncRNA-1 causes the loss of pluripotency and prevents genotoxic stress-induced cell death in hESCs) (2022)
  • Author(s): 山形 一行, ザハラ・シティ, 橋本 直子, 中山 哲俊, 藤本 真徳, 横山 真隆, 田中 知明
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 新規p53標的遺伝子lncRNA-1のヒト乳がん細胞と肝細胞がん細胞での機能(The functional roles of p53-inducible lncRNA-1 on human breast cancer cells and hepatocellular carcinoma cells) (2022)
  • Author(s): ザハラ・シティ, 山形 一行, 中山 哲俊, 橋本 直子, 藤本 真徳, 横山 真隆, 宮 英博, 石 暁彦, 田中 知明
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会