Significance and Mechanisms of Phase Separation Mediated by Cancer-Driving Fusion Oncoprotein EML4-ALK as Revealed by High-Speed AFM

• Project/Area Number: 22K07208
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: HAN XUJUN 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (30872163)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: EML4-ALK / HS-AFM / Phase separation

Outline of Research at the Start

(1) EML4-ALK dynamic structures by HS-AFM imaging (Year 1)
(2) Interaction of EML4-ALK/Associating protein (AP) (Year 1-2)
(3) Phase separation and physiological significance (Year 2-3)

Outline of Annual Research Achievements

EML4遺伝子とALK遺伝子の融合によって新たに生じるALK4-EML融合タンパク質は、肺がんに対する強力な発がんドライバータンパク質として機能するが、分子内にIntrinsically Disordered Region（IDR）領域をもつこと、EML4-ALKの精製が難しいことなどによって、チロシンキナーゼドメインを除くとその全体構造は未解明であった。本研究では、EML4-ALK variant-1 / variant-3 / variant-5、それぞれをHEK293細胞にて発現し、高度に精製されたEML4-ALKタンパク質について、高速AFM（原子間力顕微鏡）による構造解析をおこなった。分子動態のリアルタイム観察により、各variantは2量体化または3量体化を示し、そのプロセスは可逆的であった。また、EML4領域のIDR内で球状サブドメイン（191 ～ 217 残基）は、一時的・可逆的な球状構造を示し、球状構造の形成は、オリゴマー化された ALK ドメインの多様なパターンに寄与することが観察された。ALKチロシンキナーゼ阻害剤であるアレクチニブは、IDRサブドメインを圧縮し、EML4-ALKオリゴマー化を抑制したことから、キナーゼドメインにおける局所的な構造変換がIDR分子動態に影響することが明らかになった。さらに、この作用は、臨床的にALK阻害剤に対する薬剤耐性に関与するALKG1202R変異では認められなかった。 これらの観察結果から、アレクチニブはALKチロシンキナーゼ活性を阻害することに加えて、EML4-ALKのIDRの構造変換を介して EML4-ALK オリゴマー化を抑制することが示唆された。以上、高速AFMによる分子動態観察によって、従来のアプローチでは解明されないEML4-ALKの分子動態とALK阻害剤の作用機作が明らかになった。