CAR-T細胞機能を向上させるCAR構造の最適化

• Project/Area Number: 22K07298
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 西尾 信博 名古屋大学, 医学系研究科, 特任准教授 (00586430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 義行 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40432273)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: GD2 / CAR / piggyBac

Outline of Research at the Start

CARの構造は1)抗原認識部位、2)スペーサー、3)共刺激分子、4)細胞内シグナル伝達ドメインにより成り立っている。共刺激分子の違いにより、サイトカイン産生能、増殖能、あるいは体内持続性が異なることが知られているが、共刺激分子以外の構成成分がCAR-T細胞の機能に与える影響は未だ不明である。本研究では、linker部分とspacer部分がCAR-T細胞の機能に与える影響を明らかにし、最適化することでより効果の高いCAR-T細胞を開発する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、CARの構成成分のうち、scFv部分の中のVHとVLをつなぐlinker部分の長さとspacer部分の長さに着目して、CARを改変し、その機能解析を実施する。 ベースとなるCARはGD2を標的としたGD2.CARを用い、遺伝子導入には代表者らが開発したpiggyBacトランスポゾン法を用いる。 異なる抗原認識部位の配列情報とCD28、4-1BBなどの異なる共刺激分子をもつGD2.CARに、さらにlinkerとspacerを改変した複数のGD2.CARコンストラクトを作成した。上記のGD2.CARを、申請者が所有するCD19.CARトランスポゾンベクター(pIRII-CAR.CD19.28.ζ)のCAR配列と入れ替え(pIRII-CAR.GD2.28.ζまたはpIRII-CAR.GD2.4- 1BB.ζ)、GD2.CARトランスポゾンベクターを作成した。GD2CAR-T細胞製造のために培養条件を最適化した。末梢血リンパ球に、ヌクレオフェクション装置を用いて、GD2.CARトランスポゾンベクターとpiggyBac遺伝子転位酵素ベクターを導入し、自家feeder細胞とインターロイキン(IL)-7およびIL-15を添加した培地中で共培養したのちに増殖刺激を加え、GD2CAR-T細胞を作成した。フローサイト メトリーを用いてT細胞上のGD2.CAR発現率、CD45RA/CCR7細胞比率等を測定した。さらにCAR-T細胞と神経芽腫細胞株をサイトカイン無添加・10%血清存在下で共培養し、GD2.CAR-T細胞の抗原特異性、細胞傷害活性、細胞表面exhaustionマーカー、CAR-T細胞のpersistencyなどを検討した。その結果をもとに免疫不全マウスを用いたin vivo実験を実施した。