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生理的機能を有するALS細胞モデルの構築とその病態解析

Research Project

Project/Area Number 22K07356
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 51030:Pathophysiologic neuroscience-related
Research InstitutionTokai University

Principal Investigator

大友 麻子  東海大学, 医学部, 講師 (50535226)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 秦野 伸二  東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords筋萎縮性側索硬化症 / ALS / 上位運動ニューロン / 下位運動ニューロン / 骨格筋 / iPS細胞 / 細胞モデル
Outline of Research at the Start

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)は、大脳皮質運動野の上位運動ニューロン(UMNs)と脳神経及び脊髄前角の下位運動ニューロン(LMNs)の選択的変性と脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。本研究では、これまでほとんど研究対象とされていない UMNsと LMNs の形成するシナプス機能や、LMNsと MSCs の結合によって形成される神経筋結合部の機能に着目し、健常者とALS細胞モデルを比較、解析することによって、ALS疾患における UMNs 及び LMNs の細胞種特異的な疾患感受性を生みだす分子メカニズムを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)は、大脳皮質運動野の上位運動ニューロン(UMNs)と脳神経及び脊髄前角の下位運動ニューロン(LMNs)の選択的変性と脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。本研究では、ALS疾患特異的障害部位である、UMNsとLMNs、及びLMNsと骨格筋(MSCs)の機能的な結合、さらにはUMNsとLMNs及び MSCs の結合を有する新たなALS細胞モデルを構築することを目的とする。本年度は、新たな細胞材料の開発とその細胞表現型の評価を進めた。ALS疾患モデル細胞として、上位運動ニューロン優位型のALS2型(ALS2変異)と、下位運動ニューロン優位型ALS6型(FUS変異)に着目した。健常者由来の人工多能性幹細胞(iPSCs)、そのALS2ノックアウトiPSCs、及びその同一遺伝子背景にFUS変異を持つiPSCsをモデルの作製に用いた。それらiPSCsを用いて、LMNsの運命決定遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現する遺伝子カセットを導入し、安定的にそれらを発現する細胞をプールとして確保した。健常者、ALS2型、FUS型のiPSCsを下位運動ニューロンへと分化誘導後、細胞生存率について解析を行った結果、分化誘導後2-3週間の時点においてもFUS細胞モデルにおいて顕著に細胞生存率が低下していた。ALS2細胞モデルを作製するために、UMNsモデル細胞の誘導をLMNsと同一の手法を用いて試みた。UMNsモデル細胞を誘導後、細胞の性質を明らかにするためにmRNA-sequencing 解析を行った結果、グルタミン酸作動性神経細胞を主とする細胞集団であることを確認した。また、MSCsについてもiPSCsに特定の遺伝子を発現させ、myoblast細胞を誘導後、一定条件下でmyotube誘導方法を確立した。現在、UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めている。本年度は、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めているが、両者のシナプス形成に有する期間が、想定していたより長く(現段階では40日以上が必要であることが判明しつつある)、実験の条件設定などに、時間を必要としている。現在、培養期間以外の培養条件の設定を継続して行っている。また、研究立案の段階では、スフェロイド様の細胞同士を用いた共培養系の確立と解析を主眼としていたが、解析の際に定量化が難しいこと、再現性が得にくいことなどの問題が生じている。そのため、マイクロデバイスを用いた平面における共培養などの様々な培養方法及び評価方法についても実験計画に導入し、その評価について検討する計画である。これらの手法を用いて、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。

Strategy for Future Research Activity

UMNsモデル細胞とLMNsの共培養の培養期間や培養条件設定を進めているが、両者のシナプス形成に有する期間が、想定していたより長いことが判明した。2種の神経細胞のみでは、シナプス形成効率が低いことが示唆される。そのため、シナプス形成を補助するグリア細胞などの共培養や、細胞外のマトリックスなどの細胞培養環境についても検討する必要がある。特に、アストロサイトとの共培養は、シナプス安定性などに一定の効果が期待できるため、アストロサイトとの共培養を試みる。また、研究立案の段階では、スフェロイド様の細胞同士を用いた共培養系の確立と解析を主眼としていたが、解析の際に定量化が難しいこと、再現性が得にくいことなどの問題が生じている。そのため、マイクロデバイスを用いた平面における共培養などの様々な培養方法及び評価方法についても実験計画に導入し、その評価について検討する計画である。これらの手法を用いて、細胞同士の共培養による細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築と解析を進める計画である。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (16 results)

All 2024 2023 2022 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (9 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Effect of PCDH19 missense mutations on cell-to-cell proximity and neuronal development under heterotypic conditions.2024

    • Author(s)
      Nami Motosugi , Akiko Sugiyama , Asako Otomo , Yuka Sakata , Takuma Araki , Shinji Hadano , Natsuhiko Kumasaka , Atsushi Fukuda
    • Journal Title

      PNAS nexus

      Volume: 3

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Central nervous system specific high molecular weight ALS2/alsin homophilic complex is enriched in mouse brain synaptosomes2023

    • Author(s)
      Sato Kai、Suzuki-Utsunomiya Kyoko、Mitsui Shun、Ono Suzuka、Shimakura Kento、Otomo Asako、Hadano Shinji
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 638 Pages: 168-175

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2022.11.061

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Personalized Treatment for Infantile Ascending Hereditary Spastic Paralysis Based on In Silico Strategies2022

    • Author(s)
      Rossi Sebastiano Matteo、Ermondi Giuseppe、Sato Kai、Otomo Asako、Hadano Shinji、Caron Giulia
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 27 Issue: 20 Pages: 7063-7063

    • DOI

      10.3390/molecules27207063

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] SQSTM1, a protective factor of SOD1-linked motor neuron disease, regulates the accumulation and distribution of ubiquitinated protein aggregates in neuron2022

    • Author(s)
      Mitsui Shun、Otomo Asako、Sato Kai、Ishiyama Masahito、Shimakura Kento、Okada-Yamaguchi Chisa、Warabi Eiji、Yanagawa Toru、Aoki Masashi、Shang Hui-Fang、Hadano Shinji
    • Journal Title

      Neurochemistry International

      Volume: 158 Pages: 105364-105364

    • DOI

      10.1016/j.neuint.2022.105364

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] マイクロデバイスを用いたFUS遺伝子変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症(ALS)細胞モデルの評価2023

    • Author(s)
      大友 麻子、西島 恵子、村上 裕太、石川 充、木村 啓志、秦野 伸二
    • Organizer
      第46回日本分子生物学会年会 (MBSJ2023)
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] FUS遺伝子変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症(ALS)細胞モデルの作出と マイクロデバイスを用いた軸索表現型の評価2023

    • Author(s)
      西島 恵子、大友 麻子、村上 裕太、石川 充、木村 啓志、秦野 伸二
    • Organizer
      15th Tokai University Micro/Nano Enlightenment
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 3次元培養筋OITem を活用した神経筋共培養の試み2023

    • Author(s)
      大友 麻子
    • Organizer
      第6回 3次元培養筋OITem研究会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] PDIはTDP-43のグアニン四重鎖依存的液液相分離を制御する2023

    • Author(s)
      石黒亮、西島恵子、村上裕太、木村啓志、秦野伸二、大友麻子
    • Organizer
      第46回日本分子生物学会年会 (MBSJ2023)
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 光変換蛍光タンパク質Dendra2を用いたSQSTM1の時空間的動態解析2023

    • Author(s)
      島倉 健人、山口千沙、湯田平 陽香、 岡 晃、大友 麻子、秦野 伸二
    • Organizer
      第46回日本分子生物学会年会 (MBSJ2023)
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] ヒトiPSCs由来下位運動ニューロンの培養と軸索表現型評価に適したマイクロデバイスの開発2022

    • Author(s)
      大友 麻子、西島 恵子、村上 裕太、石川 充、木村 啓志、秦野 伸二
    • Organizer
      第45回日本分子生物学会年会 (MBSJ2022)
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 筋萎縮性側索硬化症責任遺伝子NEK1およびALS2の機能的連関が神経細胞表現型に及ぼす影響2022

    • Author(s)
      湯田平 陽香、佐藤 海、 島倉 健人、石川 充、大友 麻子、秦野 伸二
    • Organizer
      第45回日本分子生物学会年会 (MBSJ2022)
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] マウス由来骨格筋とヒト由来下位運動ニューロンの共培養による神経筋結合部の構築とその機能評価2022

    • Author(s)
      内藤 佳津子、大友 麻子、秦野伸二
    • Organizer
      第56回日本実験動物技術者協会総会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 光変換蛍光タンパク質Dendra2を用いたSQSTM1細胞内動態観察2022

    • Author(s)
      島倉 健人、山口 千沙、湯田平 陽香、岡 晃、大友 麻子、秦野 伸二
    • Organizer
      第45回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Book] Autophagy Dysfunction in Alzheimer's Disease and Dementia 担当:共著, 範囲:1. Degradation mechanisms of cells (Edited by Tadanori Hamano & Tatsuro Mutoh)2022

    • Author(s)
      Asako Otomo, Shinji Hadano
    • Total Pages
      356
    • Publisher
      ELSEVIER/Academic Press
    • ISBN
      9780323899062
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Remarks] 東海大学 医学部医学科 基礎医学系生体機能学 分子神経病態科学研究室(秦野 & 大友研究室)

    • URL

      http://mls.med.u-tokai.ac.jp/hadano/

    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Remarks] 東海大学マイクロ・ナノ研究開発センター

    • URL

      http://www.mnc.u-tokai.ac.jp/?page_id=2&lang=ja

    • Related Report
      2023 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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