Analysis of pathological dynamics of membrane-less organelles in SALS

• Project/Area Number: 22K07372
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 51030:Pathophysiologic neuroscience-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 多田 美紀子 横浜市立大学, 医学研究科, 客員講師 (30722467)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土井 宏 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10326035) ; 竹内 英之 横浜市立大学, 医学研究科, 客員教授 (30362213) ; 田中 章景 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30378012)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: ALS / FTLD / 非膜オルガネラ / RNA結合タンパク質

Outline of Research at the Start

ALSの病態メカニズムとしてTDP-43やFUSなどのRBPが細胞質内に凝集体を形成することから非膜オルガネラの中でもストレス顆粒が着目されてきた。一方、核内非膜オルガネラについては、それらの形成に共通してLLPSが関わることが明らかになる以前に、一つ一つの構造物に注目した研究が散見される程度であった。本研究では各種核内非膜オルガネラをALSにおいて共働して病態に関与する構造物として捉え、ALS剖検例30例を対象に非膜オルガネラがALS剖検神経組織においてどのような構造、形態を示すかを各々の相互関係を含めて系統的に明らかにすること、また培養細胞、ヒト凍結組織に関して生化学的な変化を解析する。

Outline of Annual Research Achievements

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は上位・下位運動ニューロンを選択的に障害する進行性神経変性疾患である。未だ疾患メカニズムは明確ではないが、これまで家族性ALSの病因遺伝子として、多数のRNA結合タンパク質(RBP)が報告され、RNA代謝異常がALSの病態形成に重要であることが示唆されてきた。これらのRBPはプリオン様ドメインを持ち、一定の条件で液-液相分離を示す傾向がある。一方、正常の核内・細胞質には液-液相分離を介し、複数の膜のないオルガネラが形成され、RNA代謝において重要な役割を担っているため、これら非膜オルガネラの異常がALS病態にかかわっている可能性が高い。本研究は多数例のALS剖検組織を用いて核内・細胞質の非膜オルガネラの形態異常について病理学的検討を行い、さらに非膜オルガネラの異常について分子細胞生物学的側面、遺伝学的側面からの検証を加えることで、ALSにおける新たな病態進展パスウェイを明らかにすることを目指すものである。本研究ではすでに集積している多数例(30例)のSALS連続剖検例(TDP-43陽性例およびFUS陽性例)において、非膜オルガネラ構造物の局在変化、非膜オルガネラ相互の関連性、凝集体への取り込みといった形態的な特徴を明らかにする。また、各種RBPの非膜オルガネラ構造物への局在を検証する。次に培養細胞(Neuro2a細胞、NSC34細胞)において、ALS病因タンパク質(野生型・変異型TDP-43あるいはFUS/TLSなど)が非膜オルガネラの減少や増加、局在変化に与える動的な影響をSTED顕微鏡で観察・定量し、SALSヒト組織で見られる非膜オルガネラの病的変化が再現可能かを検証する。さらに、ALS/FTLDと疾患コントロールのヒト検体凍結組織を用いて各種核内オルガネラの定量解析を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では代表者らが集積している多数例(30例)のSALS連続剖検例(TDP-43陽性例およびFUS陽性例)において、非膜オルガネラ構造物の局在変化、非膜オルガネ ラ相互の関連性、凝集体への取り込みといった形態的な特徴の形態学的評価を行った。非膜オルガネラであるCajal小体について、抗coilin抗体を用いて、さらに15例のSALS症例の脊髄切片を用いてコントロールと比較した免疫組織学的評価を行い、TDP-43、FUS/TLSとの共局在を確認することができた。

Strategy for Future Research Activity

今後はそれぞれの非膜オルガネラに対し、核小体は抗Nucleolin抗体、パラスペックルは抗NONO抗体、PML小体は抗PML抗体、GEMは抗SMN1抗体を用いて評価する予 定である。次に培養細胞(Neuro2a細胞、NSC34細胞)において、ALS病因タンパク質(野生型・変異型TDP-43あるいはFUS/TLSなど) が非膜オルガネラの減少や増 加、局在変化に与える動的な影響をSTED顕微鏡で観察・定量し、SALSヒト組織で見られる非膜オルガネラの病的変化が再現可能かを検証する。さらに、ALS/FTLD と疾患コントロールのヒト検体凍結組織を用いて各種核内オルガネラの定量解析を行う。