| Project/Area Number |
22K07427
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52010:General internal medicine-related
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
相羽 由詞 自治医科大学, 医学部, 講師 (60783694)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 真弥 自治医科大学, 医学部, 准教授 (60614956)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | Acinetobacter baumannii / CRISPR-Cas13 / バクテリオファージ / 抗菌カプシド / 簡易遺伝子型別法 |
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| Outline of Research at the Start |
薬剤耐性菌の出現と蔓延は世界規模の公衆衛生上の問題である。耐性菌を制御するためには、迅速かつ高精度な耐性遺伝子の検出システムが必須となる。しかし、現行の日常臨床検査において遺伝子同定は操作の煩雑さや費用面から実施が困難である。本申請では、配列特異的な標的遺伝子を認識して殺菌するCRISPR-Cas13a配列を細菌に感染するバクテリオファージに搭載した抗菌カプシドを開発することで、核酸の増幅を必要としない新たな細菌遺伝子の鑑別法を確立する。本申請の成果は、薬剤耐性菌問題の克服に向けた適正な抗菌治療や予防の感染制御に役立つ、新しく強力な分子疫学ツールを提供することができる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、世界中でAcinetobacter baumannii のカルバペネム耐性菌が増加傾向にあり、抗菌薬治療の選択肢が大幅に制限されている。本菌は細胞間で耐性遺伝子を受け渡すことで簡単に耐性化する。適正な抗菌薬治療や感染制御対策を行うためには、迅速かつ高精度な耐性遺伝子の検出システムが必須となる。しかし、 現行の日常臨床検査において遺伝子同定は操作の煩雑さや費用面から実施が困難である。当研究室では独自に、配列特異的な標的遺伝子を認識して殺菌する CRISPR-Cas13a配列をバクテリオファージ(ファージ)に搭載した抗菌カプシドを開発した。本技術は核酸の増幅を必要としない細菌遺伝子の鑑別法である。申請者は、本殺菌効果が極めて強力かつ完璧な配列相同性を要求することを見出し、遺伝子型別法への応用が充分に可能だと考えた。
本年度は、臨床分離Acinetobacter baumannii144株からマイトマイシンCを用いて細菌の染色体上に組み込まれているプロファージ(溶原性ファージ)の誘発条件の最適化に成功した。アシネトバクター感染症への治療薬を開発するために、アシネトバクターファージの分離法を確立した。臨床分離Acinetobacter baumannii144株を用いて864個の溶原化ファージ溶液から、32株の溶原化ファージの分離に成功した。そのファージは、144菌株に対する宿主感染域が14.5から 65.7%を示した。宿主感染域が29.4から65.7%のプロファージ8株のゲノム解析を実施し、CRISPR-Cas搭載に関連する遺伝子も同定した。本申請の成果は、検体細 菌と抗菌カプシドを混合培養し増殖の有無を目視するだけで判定できる。さらに、医療現場の業務や費用の負担軽減に繋がる強力な検査ツールを提供することができると確信している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、標的遺伝子配列を特異的に認識できる簡便な遺伝子型別法を開発するために、標的遺伝子の選定と特異的配列を認識するガイドRNAの設計および評価を進めた。Acinetobacter baumanniiが持つ耐性遺伝子であるカルバペネマーゼ遺伝子のIMP型とOXA型をモデル遺伝子として30個のガイドRNAをそれぞれ設計した。遺伝子変異検出で最も感度の高かったガイドRNA配列は、有意な変異識別による細菌の増殖抑制が認められた。その一方で、ほとんど殺菌効果を示さない配列も存在した。そのため、ガイドRNAを慎重に設計することで、高感度に標的細菌が持つ耐性遺伝子を検出する能力があることを明らかにした。現在、標的遺伝子の認識の精度をさらに高めるために、ガイドRNAの塩基長など詳細を調査することによって、殺菌効果の向上を目指している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、これまでに申請者が独自に取得した臨床分離Acinetobacter baumanniiからファージ誘発法を用いて分離したプロファージと標的遺伝子を認識できるガイドRNAを用いて、多剤耐性アシネトバクターの簡易遺伝子型別法に利活用できる抗菌カプシドの構築を実施する。抗菌カプシドを構築するために、Acinetobacter baumanniiと宿主感染域が広いプロファージ8株のゲノム解析を完了している。さらに、ベクタープラスミドも入手済みである。現在、取得したゲノム情報を基にCRISPR-Cas13aの搭載を進めている。また、標的遺伝子を認識できるガイドRNA配列の最適化も並行して実施している。構築した抗菌カプシドは、臨床分離株Acinetobacter baumanniiを用いて、多剤耐性菌が持つ耐性遺伝子を高感度に鑑別できることを検証する。
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