| Project/Area Number |
22K07488
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52010:General internal medicine-related
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
北中 明 川崎医科大学, 医学部, 教授 (70343308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
通山 薫 川崎医療福祉大学, 医療技術学部, 教授 (80227561)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | CD38 / daratumumab / 抗体療法 / シグナル伝達 |
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| Outline of Research at the Start |
多発性骨髄腫の治療薬として臨床応用された抗CD38抗体は、その高い有効性により標準治療を一変させた。われわれの研究からは、抗CD38抗体の抗腫瘍効果には抗体結合後に引き起こされる細胞内チロシンキナーゼの活性化が重要であり、シグナル伝達におけるFc受容体の関与が示唆されている。本研究では、抗CD38抗体の刺激後に活性化されるシグナル分子が抗CD38抗体の作用に及ぼす分子機構を明らかとし、その制御によって抗腫瘍効果を増強する手法の確立を図る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
われわれはマウス抗CD38抗体がさまざまな造血器腫瘍細胞に増殖抑制・アポトーシス誘導効果を示すことを発見し、CD38を標的分子とした抗体療法、免疫療法の検討を行ってきた。これまでに抗腫瘍効果を十分に発揮するためにはマウス抗CD38抗体のFc部分の存在が重要であり、抗体の結合後にFc受容体をシグナル伝達の起点とする細胞内チロシンキナーゼ（PTK）の活性化が惹起されることを見出している。この発見を受け、われわれは標的細胞に結合した抗CD38抗体のFc部分が、同じく標的細胞上に発現するFc受容体と結合することで抗腫瘍効果を増強するメカニズムを提唱している。
われわれが作成したヒトCD38高発現モデルであるBa/F3-CD38細胞に、臨床的に使用されているヒト型IgG1 kappaモノクローナル抗体daratumumab (DARA)を作用させたところ、細胞増殖抑制効果を有するマウス抗CD38抗体（T16）の場合と同様の細胞内チロシンリン酸化が惹起された。また、完全長のDARAがPTKを活性化するのに対し、DARAのF(ab')2断片は、PTK活性化を引き起こさなかった。
Ba/F3-CD38細胞はマウス抗CD38抗体によって惹起される細胞内チロシンリン酸化の観察に最適化されたモデル細胞であるが、臨床的にDARAの標的となる造血器悪性腫瘍細胞よりも多量のCD38抗原を細胞表面に発現している。そのため、内因性のCD38分子を発現しているヒト細胞株においてDARAの効果を確認したところ、複数のヒト細胞株で、Ba/F3-CD38細胞に認められたものと同様の細胞内チロシンリン酸化が観察された。
また、クロスリンク実験によって、DARAのFc部分は、生化学的事象のみならず、細胞生物学的機能の発揮に関しても重要であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
われわれはBa/F3-CD38細胞が抗CD38抗体によるPTK活性化の観察に最適な細胞であることを明らかとしている。DARAによる刺激は、Ba/F3-CD38細胞にマウス抗CD38抗体と同様のチロシンリン酸化を惹起させ、RS4;11、REHなどのヒト細胞株においても、同程度の細胞内チロシンリン酸化を引き起こした。
完全長のDARAによる刺激がPTKを活性化するのに対し、DARAのF(ab')2断片はPTK活性化を惹起しなかった。Ba/F3-CD38細胞の表面にDARA F(ab')2を結合させた後、二次抗体を用いてCD38分子のクロスリンク実験を行なったところ、 DARA F(ab')2を完全長のウサギ抗ヒトIgGで架橋した場合にのみ、チロシンリン酸化が観察された。このことは、DARAを介したPTKの活性化に Fc部分の存在が必須であることを示している。
引き続いて細胞増殖抑制効果を指標にDARAの作用をヒト細胞株を用いて解析した。完全長の DARAは、バーキットリンパ腫由来細胞株Daudiの増殖をDARA F(ab')2よりも有意に強く抑制した。次に、Daudi細胞の表面にDARA F(ab')2を結合させた状態で完全長のウサギ抗ヒトIgGまたはウサギ抗ヒトIgG F(ab')2 を加えたところ、完全長のウサギ抗ヒトIgGで架橋を行った方が、より強力な細胞増殖抑制作用を示した。これらより、DARAの作用機序について、チロシンリン酸化を指標とした生化学的な解析と、細胞増殖抑制効果を指標とした細胞生物学的な解析は、ともにFc部分の重要性を示す結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討によって、CD38発現細胞に対するDARAの増殖抑制作用におけるFc部分の役割を解析するために必要なモデル細胞株の選定は概ね終了した。マウス抗CD38抗体を用いた解析では、CD38刺激が、B細胞受容体（BCR）シグナルに重要なCD19やLyn、PI3-キナーゼを活性化することから、これらB細胞関連のシグナル分子がCD38分子を起点としたシグナル伝達に関与することが想定されたが、初期の古典的解析手法では、CD19などの細胞表面分子とCD38の直接的な会合を証明することができず、その活性化機序を明らかにできなかった。その後、CD38はIgMクラスBCR（IgM-BCR）の成分である膜結合IgM、Igα、Igβ、CD81と共局在することが報告され（Deaglio他、2003 年）、抗体やクロスリンク剤あるいはCD31を介した刺激で、CD38がCD19/CD81複合体とともにキャップ領域に再局在化することが見出されている（Deaglio他、 2007）。最近になって、CD38がCD19と近接し、BCR刺激の後にIgM-BCRと近接することが見出された（Camponeschi他、2022）。DARAに代表される抗CD38抗体の結合や、CD38のサイレンシングがBCRシグナルを阻害することも示され、CD38がIgM-BCR を介したB細胞の活性化に不可欠な分子であることが想定されている。これまでに解析してきたDaudi細胞は細胞表面にIgMを発現していることから、BCRシグナルにおけるCD38分子の存在意義、DARAがIgM-BCR陽性細胞に及ぼす影響などの検討に適しており、これまでヒト細胞の検討として主に未分化B細胞株をサンプルとして得た解析結果に、新たな知見を加えることが可能になると期待される。
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