不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清による実験的自己免疫性神経炎の治療効果

• Project/Area Number: 22K07504
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52020:Neurology-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 宮川 聡美 東京医科大学, 医学部, 兼任助手 (40931324)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞 / 培養上清 / 実験的自己免疫性神経炎

Outline of Research at the Start

今日、間葉系幹細胞を用いた細胞療法が盛んであるが、その細胞培養上清（CM）の投与でも効果があり、免疫拒絶を考慮する必要もなく、安全性も高いため注目されている。当研究室では、最近、ヒト脱落乳歯由来の歯髄幹細胞（SHED）に不死化遺伝子を導入し安定的に高い増殖性を示す細胞株を作製した。歯髄幹細胞は、元々神経系由来のため、本研究では、まず、末梢神経障害の病気であるギラン・バレー症候群のマウスモデルである実験的自己免疫性神経炎モデルマウスを用いて、SHED-CMの治療効果とその作用機序について明らかにし、さらに、他の末梢神経障害の病気への応用の可能性についても検討する。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、実験的自己免疫性神経炎(EAN)モデルにおける不死化ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清（SHED-CM）の治療効果について検討を行った。
① EANモデルマウスでの治療効果：末梢神経ミエリン蛋白0（P0）180-189ペプチドをCFAと共に1習慣開けて2度免疫し、百日咳毒素を静注し、神経炎を発症させ、臨床スコアーがピークの15日目から2日に1回不死化SHED-CMおよびそのコントロール培地を200 μlずつ複数回腹腔内投与したところ、SHED-CM投与により有意に臨床スコアーの軽減が認められた。さらに、トレッドミルを用いて運動機能を測定すると、運動機能の改善が見られる傾向にあった。1ヶ月後に、坐骨神経のウエスタンブロット解析により、ミエリン塩基性蛋白質（MBP）の発現上昇や、電子顕微鏡解析により神経軸索のミエリンの厚みやその数の増加、さらに、坐骨神経でシュワン細胞の脱分化に重要な転写因子c-Jun発現の低下と逆にシュワン細胞の分化に重要な転写因子Egr2発現の増強が見られた。
② SHED-CMのサイトカイン網羅解析：SHED-CM中のサイトカイン量を抗体アレイを用いて網羅的に定量すると、上位にHepatocyte growth factor（HGF）が検出された。そこで、EAN免疫開始から23日後の坐骨神経のウエスタンブロット解析により、SHED-CM投与によりHGFの受容体であるc-METのリン酸化の増強が見られた。次に、HGFの抗体を用いてSHED-CMよりHGFを免疫除去したSHEDとそのコントロール抗体で同様に処理したSHED-CMをEANマウスに投与すると、HGFの免疫除去によりSHED-CMのEAN発症抑制効果がキャンセルされる傾向にはあった。そこで、今度はHGFのsiRNAおよびコントロールのsiRNAをSHED細胞に遺伝子導入し、その培養上清を回収して、EANマウスに投与したが、EAN発症の抑制効果のキャンセルは弱かった。現在、他の分子の関与も含めて検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

不死化ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清（SHED-CM）による実験的自己免疫性神経炎(EAN)の抑制効果が明らかになってきたので、ほぼ計画の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

2023年度：マウスシュワン細胞株IMS32を用いた作用機序の検討
① SHED-CMの蛋白質分子の関与：IMS32細胞に、SHED-CMとそれを超遠心により分離した上清分画とエクソソームを共存させて培養し、増殖増強効果を調べる。次に、上述の検討で得られた分子に対する中和抗体を共存させて、増殖誘導がキャンセルされるか検討する。効果があればEAN発症マウスに投与しその関与を明らかにする。② SHED-CMのエクソソームの関与：エクソソームの関与も見られれば、次に、miRNA Arrayを用いて網羅的に発現解析を行い、神経細胞の損傷修復・再生に関わるmicroRNAの候補を複数選択し、それらのmicroRNAを作製し、IMS32細胞に加えて増殖に影響を与えれば、その標的分子の蛋白質レベルでの発現低下をウエスタンブロットにより解析し、作用機序を明らかにする。

2024年度：当初は、CIPNモデルマウスにおけるSHED-CMの治療効果について検討する予定であったが、最近、予備的実験より、マウス脾臓由来ナイーブCD4+T細胞を固相化抗CD3抗体+抗CD28抗体で刺激する際、SHED-CMを加えると、細胞増殖を抑制する結果を得た。すなわち、SHED-CMによるEANの治療効果に、シュワン細胞への直接の増殖・分化や再生誘導のみにならず、免疫抑制効果も関与している可能性が示唆された。そこで、まず、同様にCD4+T細胞を刺激し、細胞増殖への効果のみならず、ELISAやFACS解析によりサイトカイン産生や制御性T（Treg）細胞およびIL-10産生細胞の分化誘導、さらに、ウエスタンブロットやRT-qPCTにより抑制性の転写因子SOCS1やSOCS3やその誘導に重要と報告されている転写因子Egr2の発現誘導などを調べる。次に、EANマウスの坐骨神経でのこららの分子の発現も同様に調べる。

Research Products

• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation. (2023)
  • Author(s): Katahira Y, Murakami M, Inoue S, Miyakawa S, Sakamoto E, Furusaka Y, Watanabe A, Sekine A, Kuroda M, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Front Immunol. Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Potent antitumor effects of the conditioned medium of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via IGFBP-4. (2023)
  • Author(s): Furusaka Y, Inoue S, Mizoguchi I, Hasegawa H, Katahira Y, Watanabe A, Sakamoto E, Sekine A, Miyakawa S, Umezu T, Owaki T, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: in press Issue: 6 Pages: 2499-2514
  • DOI: 10.1111/cas.15789
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemical- and Drug-Induced Allergic, Inflammatory, and Autoimmune Diseases via Haptenation. (2023)
  • Author(s): Sakamoto E, Katahira Y, Watanabe A, Furusaka Y, Sekine A, Yamagishi M, Sonoda J, Miyakawa S, Inoue S, Hasegawa H, Yo K, Yamaji F, Toyoda T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Biology (Basel) Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 123-123
  • DOI: 10.3390/biology12010123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Protective effect of conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Hasegawa H, Sakamoto E, Katahira Y, Miyakawa S, Murakami F, Inoue S, Watanabe A, Furusaka Y, SekineA, Owaki T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清投与による実験的自己免疫性神経炎の治療効果 (2022)
  • Author(s): 善本隆之、長谷川英哲、片平泰弘、井上槙也、古阪悠馬、坂本恵梨、渡邉有麻、宮川聡美、大脇敏之、溝口 出
  • Organizer: 第21回日本再生医療学会総会
• [Presentation] 不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED-CM）培養上清の褥瘡モデルマウス皮膚潰瘍に対する治療効果 (2022)
  • Author(s): 片平泰弘、長谷川英哲、井上槙也、古阪悠馬、坂本絵梨、渡邉有麻、関根碧水、宮川聡美、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第21回日本再生医療学会総会
• [Presentation] Inhibitory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on tumor growth and its possible molecular mechanism. (2022)
  • Author(s): Furusaka Y, Katahira Y, Hasegawa H, Umezu T, Mizoguchi I, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth exhibit protective effect on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Sakamoto E, Hasegawa H, Katahira Y, Miyakawa S, Watanabe A, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第51回日本免疫学会総会・学術集会
• [Patent(Industrial Property Rights)] 不死化間葉系幹細胞の上清を含む末梢神経障害治療用医薬組成物、及びその組成物を有効成分とする医薬製剤 (2022)
  • Inventor(s): 善本隆之、溝口出
  • Industrial Property Rights Holder: 善本隆之、溝口出
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2022-031332
  • Filing Date: 2022