ミトコンドリアスフェロイド化不全を起点としたドーパミン神経細胞死の機序解明

Research Project

Project/Area Number	22K07523
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52020:Neurology-related
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	横田睦美順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (10647415)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	PRKN変異 / TH-GFP iPS細胞 / ドーパミン神経細胞 / 近接ライゲーションアッセイ / ドーパミン神経細胞死 / 光顕・電顕相関観察 / トランスクリプトーム
Outline of Research at the Start	パーキンソン病におけるドーパミン神経変性の主因としてミトコンドリアを中心としたオルガネラ異常が示唆されているが、ドーパミン神経特異的な細胞死の機序はほとんど明らかにされていない。研究代表者は最近ドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現するiPS細胞（TH-GFP iPS細胞）を健常者及びPRKN変異患者にて作出し、ストレス下でのミトコンドリア形態変化が患者で有意に抑制されていることを見出している。本研究ではTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の光顕・電顕相関観察やトランスクリプトームを通じて、PRKN変異患者のドーパミン神経細胞死に至るまでのオルガネラ構造変化や分子機序を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的なオルガネラの構造変化や変性機序を見出すことを主目的としている。本研究ではこれまでに樹立したドーパミン神経マーカーTyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子にGFP遺伝子をノックインした健常者及びPRKN変異患者TH-GFP iPS細胞株を用いている。TH-GFP iPS細胞由来GFP陽性ドーパミン神経細胞のトランスクリプトーム解析からミトコンドリアと小胞体の接触部位（ERMCS）に着目した。GFP陽性ドーパミン神経細胞の光顕電顕相関観察と近接ライゲーションアッセイの結果、PRKN変異患者においてERMCSの減少が認められ、ミトコンドリアストレスCCCP処理によりさらにERMCSが減少することが明らかになった。TH-GFP iPS細胞とは別のPRKN変異患者iPS細胞由来ドーパミン神経細胞においても近接ライゲーションアッセイを行ったところ同様の傾向が認められた。また、小胞体からミトコンドリアへのカルシウムイオン流入について解析するため、GFP陽性ドーパミン神経細胞においてレンチウイルスを介してCEPIA3mtを発現させ、ヒスタミン刺激によるCEPIA3mtの蛍光強度変化を測定した。その結果、患者ドーパミン神経細胞においてヒスタミン刺激によるミトコンドリアへのカルシウムイオン流入が減少していることも明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason TH-GFP iPS細胞を利用した光顕電顕相関観察やミトコンドリアカルシウムイメージングにより、小胞体とミトコンドリアの接触部位がPRKN変異患者において減少していることを形態的・機能的に示すことができ、今回の研究結果は重要な進展であった。これまでの研究により樹立したTH-GFP iPS細胞を用いることでドーパミン神経細胞特異的なオルガネラの形態学的解析やライブイメージングが可能となっており、今回初めて、PRKN変異ドーパミン神経細胞におけるミトコンドリアカルシウムイメージングを行った。パーキンソン病におけるミトコンドリアと小胞体の接触部位の変化については増加と減少の両方の報告があるが、今回の研究によりPRKN変異患者ドーパミン神経細胞において接触部位が減少しているという結果が得られた。ミトコンドリアと小胞体の接触部位に対するアゴニストによるPRKN変異患者ドーパミン神経細胞死への影響を検証することにより、パーキンソン病患者ドーパミン神経細胞死との関連を明らかにできる可能性がある。
Strategy for Future Research Activity	ドーパミン神経細胞死におけるERMCSの意義について明らかにするため、PRKN変異患者TH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞に対するERMCSタンパク質アゴニスト（PRE-084）処理を行う。PRE-084処理に伴うミトコンドリアカルシウム濃度変化、ミトコンドリア機能変化、細胞質のカルシウム濃度変化、細胞死抑制効果をそれぞれCEPIA3mt発現、TMRM染色、Fura 2-AM染色、cleaved caspase-3染色により評価する。これらの解析により、PRKN変異患者におけるERMCSの減少とドーパミン神経細胞変性との関連解明を目指す。