| Project/Area Number |
22K07523
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52020:Neurology-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
横田 睦美 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (10647415)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | iPS細胞 / ドーパミン神経細胞 / ミトコンドリア / PRKN変異 / コンタクトサイト / TH-GFP iPS細胞 / 近接ライゲーションアッセイ / ドーパミン神経細胞死 / 光顕・電顕相関観察 / トランスクリプトーム |
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| Outline of Research at the Start |
パーキンソン病におけるドーパミン神経変性の主因としてミトコンドリアを中心としたオルガネラ異常が示唆されているが、ドーパミン神経特異的な細胞死の機序はほとんど明らかにされていない。研究代表者は最近ドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現するiPS細胞（TH-GFP iPS細胞）を健常者及びPRKN変異患者にて作出し、ストレス下でのミトコンドリア形態変化が患者で有意に抑制されていることを見出している。本研究ではTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の光顕・電顕相関観察やトランスクリプトームを通じて、PRKN変異患者のドーパミン神経細胞死に至るまでのオルガネラ構造変化や分子機序を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的なオルガネラの構造変化や変性機序を見出すことを主目的としている。
本研究ではドーパミン神経細胞マーカーTyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子にGFP遺伝子をノックインした健常者及びPRKN変異患者TH-GFP iPS細胞株を用いている。これまでの研究によりPRKN変異患者ドーパミン神経細胞においてミトコンドリアと小胞体の接触部位（ERMCS）の減少と小胞体からミトコンドリアへのカルシウムイオン流入減少が明らかとなった。今年度はさらに、細胞質カルシウムイメージングを行った結果、細胞質カルシウムイオン濃度に関しては健常者とPRKN変異患者間で有意な差は認められなかった。この結果とこれまでの研究結果から、PRKN変異患者ドーパミン神経細胞において、細胞質カルシウムイオン濃度非依存的にミトコンドリアへのカルシウムイオン流入が減少していることが示唆された。これらの成果をまとめてFrontiers in Cell and Developmental Biology誌に発表した。
また、ドーパミン神経細胞分化におけるミトコンドリアの機能・形態やERMCSの役割を明らかにするため、まず健常者TH-GFP iPS細胞を用いてiPS細胞、神経前駆細胞、ドーパミン神経細胞各分化段階におけるミトコンドリア膜電位をTMRM染色によるライブイメージングにて解析した結果、GFP陰性非ド-パミン神経細胞ではミトコンドリアの膜電位が分化に伴って上がるのに対し、GFP陽性ドーパミン神経細胞はミトコンドリア膜電位はほとんど上がらないという結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TH-GFP iPS細胞を利用した光顕電顕相関観察やミトコンドリアカルシウムイメージングにより、ERMCSがPRKN変異患者ドーパミン神経細胞において減少していることを示した成果を論文化したという点で重要な進展であったと言える。これまでPRKN変異患者ドーパミン神経細胞においてERMCSを解析した論文はほとんどなく、TH-GFP iPS細胞を用いることでドーパミン神経細胞特異的なERMCSの機能・形態学的解析が実現した。
また、一般的に神経幹細胞から神経細胞へと分化すると代謝系が解糖系から酸化的リン酸化優位となり、ミトコンドリアの形態も長く管状になると言われている。そのため、非ドーパミン神経細胞への分化におけるミトコンドリア膜電位上昇は予想通りの結果であったが、ドーパミン神経細胞分化においてミトコンドリア膜電位がほとんど上昇しないというのは予想外の結果であった。ドーパミン神経細胞の脆弱性の要因の一つとなっている可能性もあり、興味深い結果が得られたと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
ドーパミン神経細胞分化におけるミトコンドリアの機能・形態やERMCSの役割を明らかにするため、健常者TH-GFP iPSを用いてiPS細胞、神経前駆細胞、ドーパミン神経細胞各分化段階のFIB-SEMによるミトコンドリア形態とERMCSの三次元形態解析を行う。これらの解析により、ミトコンドリアの機能やERMCSについてもミトコンドリア膜電位と一致した傾向が認められるかを確認し、ドーパミン神経細胞分化におけるミトコンドリアの機能・形態やERMCSとの関連を明らかにする。
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