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低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム-細胞外リンのシグナル及びATPの関与-

Research Project

Project/Area Number 22K07837
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research InstitutionOsama Woman's and Children's Hospital

Principal Investigator

山崎 美和 (若林美和)  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 骨発育疾患研究部門, 流動研究員 (50455549)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
KeywordsTNSALP / Phosphate / 低ホスファターゼ症 / リン
Outline of Research at the Start

組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)の機能喪失変異に基づく低ホスファターゼ症(Hypophosphatasia; HPP)は骨石灰化障害を示すが、HPPの病態形成機構は完全には理解されていない。我々は最近、細胞外ATPがTNSALPの基質となることを明らかにした。本研究においてはTNSALPを欠損させたiPS細胞をHPPのモデルとして使用し、細胞外リンにより惹起されるシグナルやATP代謝の変化がHPPの病態形成にどのように関わっているのか解明する。

Outline of Annual Research Achievements

低ホスファターゼ症(HPP)は組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)をコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。そこで、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析を行っている。
健常人由来iPS細胞株にALPLのExon 3, 4の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失とフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。複合ヘテロ変異が同定されたKOクローン#1及び#2と片アレルにのみ変異が誘導されたhetero KO を解析に用いた。KO #1及び#2においてはTNSALP酵素活性が完全に喪失しており、hetero KOはisogenic controlの半分程度の残存活性を保持していた。リン供与体としてβグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて培養したところ、KO においては、in vitro石灰化が著明に抑制されていた。一方hetero KOにおいては、培養2週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。βグリセロリン酸の代わりに3 mMのリン酸を含む培地を用いて分化誘導したところ、KO #1及び#2においても石灰化は回復したが、ハイドロキシアパタイトに特異的に結合するOsteoImage蛍光色素による染色性はisogenic controlやhetero KOとは異なっていた。分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2の発現は維持され、OSTEOPONTINの発現が増加していた。また、KOでは細胞外ATPが増加し、ATP受容体の発現が変化していた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりALPL両アレルに変異を有する複合ヘテロiPS細胞と片アレル性ヘテロ変異のiPS細胞を樹立することに成功している(HPPモデル細胞の樹立)。さらにこれらの細胞を骨芽細胞分化誘導することに成功しており、isogenic controlを使用した正常な石灰化と複合ヘテロiPS細胞を使用した異常な石灰化に分けてin vitroでの解析が進んでおり興味深い結果が得られているため。

Strategy for Future Research Activity

TNSALPの産物である細胞外リン酸はシグナル分子として遺伝子発現や細胞の挙動を制御することを我々は以前報告しており、HPPにおいては細胞外リン酸惹起シグナルの減弱が病態形成に関与している可能性があると考えている。よってHPPモデル細胞とisogenic controlを骨芽細胞に分化誘導し、細胞外リン酸濃度の違いとリン酸応答遺伝子の発現の解析を進める。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (14 results)

All 2024 2023 2022 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 2 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Complex intrinsic abnormalities in osteoblast lineage cells of X-linked hypophosphatemia: Analysis of human iPS cell models generated by CRISPR/Cas9-mediated gene ablation2024

    • Author(s)
      Nakanishi Tatsuro、Yamazaki Miwa、Tachikawa Kanako、Ueta Ayu、Kawai Masanobu、Ozono Keiichi、Michigami Toshimi
    • Journal Title

      Bone

      Volume: 181 Pages: 117044-117044

    • DOI

      10.1016/j.bone.2024.117044

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Extracellular Phosphate, Inflammation and Cytotoxicity2022

    • Author(s)
      Michigami Toshimi、Yamazaki Miwa、Razzaque Mohammed S.
    • Journal Title

      Adv Exp Med Biol

      Volume: 1362 Pages: 15-25

    • DOI

      10.1007/978-3-030-91623-7_3

    • ISBN
      9783030916213, 9783030916237
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Osteocytes and the pathogenesis of hypophosphatemic rickets2022

    • Author(s)
      Yamazaki Miwa、Michigami Toshimi
    • Journal Title

      Frontiers in Endocrinology

      Volume: 13 Pages: 1005189-1005189

    • DOI

      10.3389/fendo.2022.1005189

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Growth-related skeletal changes and alterations in phosphate metabolism2022

    • Author(s)
      Michigami Toshimi、Tachikawa Kanako、Yamazaki Miwa、Nakanishi Tatsuro、Kawai Masanobu、Ozono Keiichi
    • Journal Title

      Bone

      Volume: 161 Pages: 116430-116430

    • DOI

      10.1016/j.bone.2022.116430

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] CRISPR/Cas9を用いた低ホスファターゼ症iPS細胞モデルの樹立および解析2023

    • Author(s)
      山﨑美和、上田亜侑、中西達郎、立川加奈子、川井正信、大薗恵一、道上敏美
    • Organizer
      第15回ALPS研究会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] X連鎖性低リン血症性くる病の骨芽細胞系列における複合的異常: PHEX欠損ヒトiPS細胞モデルを用いた解析2023

    • Author(s)
      中西達郎、山崎美和、立川加奈子、川井正信、大薗恵一、道上敏美
    • Organizer
      第41回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Complex Abnormalities in Osteoblasts/Osteocytes of X-Linked Hypophosphatemia: Analysis of PHEX-Knockout Human iPS Cells Generated by CRISPR/Cas9 Genome Editing.2023

    • Author(s)
      Toshimi Michigami, Tatsuro Nakanishi, Miwa Yamazaki, Kanako Tachikawa, Ayu Ueta, Masanobu Kawai, Keiichi Ozono
    • Organizer
      ASBMR 2023 Annual Meeting
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 成長に伴うリン代謝変化の細胞分子機序2022

    • Author(s)
      道上敏美、立川加奈子、山崎美和、中西達郎、川井正信、大薗恵一
    • Organizer
      第55回日本小児内分泌学会学術総会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] Growth-related Skeletal Changes and Alterations in Phosphate Metabolism from Youth to Adulthood2022

    • Author(s)
      Toshimi Michigami, Kanako Tachikawa, Miwa Yamazaki, Tatsuro Nakanishi, Masanobu Kawai, Keiichi Ozono
    • Organizer
      ASBMR 2022 Annual Meeting
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] CRISPR/Cas9によるPHEX欠損ヒトiPS細胞の樹立および解析2022

    • Author(s)
      中西達郎、山崎美和、立川加奈子、川井正信、大薗恵一、道上敏美
    • Organizer
      第40回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 成長に伴う骨成熟はFGF23-Bone-Kidney axisのシフトをもたらす2022

    • Author(s)
      道上敏美、立川加奈子、山﨑美和、中西達郎、川井正信、大薗恵一
    • Organizer
      第95回日本内分泌学会学術総会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 骨芽細胞におけるIII型ナトリウム/リン酸共輸送担体の欠損は骨形成関連遺伝子の発現減少にもかかわらず石灰化の亢進を示す2022

    • Author(s)
      山﨑美和、川井正信、木下さおり、立川加奈子、中西達郎、大薗恵一、道上敏美
    • Organizer
      第95回日本内分泌学会学術総会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Remarks] 骨格形成等についての研究内容|大阪母子医療センター

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/bone/content.html

    • Related Report
      2023 Research-status Report 2022 Research-status Report
  • [Remarks] 研究業績(骨発育疾患研究部門)|大阪母子医療センター

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/bone/work.html

    • Related Report
      2023 Research-status Report 2022 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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