新規ベクターを用いた血液系遺伝病の安全なゲノム編集治療技術の開発

• Project/Area Number: 22K07852
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: プライム編集 / ゲノム編集 / アデノウイルスベクター / iPS 細胞 / prime editing / ウイルスベクター / SCID-X1

Outline of Research at the Start

prime editing（PE）は、染色体を切断せずかつ鋳型DNAを必要としない、新規の安全なゲノム編集技術である。しかし、既存のウイルスベクターで運ぶにはPEの遺伝子サイズが大きすぎるため、高効率な遺伝子導入・発現が喫緊の課題である。本研究では、容量が大きくかつ高発現を得ることが出来る新世代型ベクターの有用性を検証する。1) レポーター遺伝子を用いた血液系細胞株におけるPEの至適化と、2) ヒト造血幹前駆細胞におけるIL2RG遺伝子座のPEによる修復の後に、3) PE処理したヒト免疫不全症モデルマーモセット骨髄細胞のマウスへの移植実験で、造血幹細胞レベルでの治療効果と安全性の検証を行う。

Outline of Annual Research Achievements

アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。
PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。
これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。
感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。
しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

改良型として、PE4遺伝子発現とepegRNA発現のベクターを別途構築した。また、PE4遺伝子発現ベクターの産生上の問題を克服するため、デザインを工夫した新たなベクターを構築し、高力価で調整した。
それらのベクターを用いて様々な細胞でPE実験を行った。K562細胞ではまだ実験は行っていないが、A549細胞やHepG2細胞で、目的の90%を越える効率でのPEに成功した。

Strategy for Future Research Activity

2022年度はAd5血清型のベクターを調整したが、造血細胞にも感染できるようにAd35血清型のヘルパーウイルスでベクターを調整する。
K562細胞とヒトCD34陽性造血幹前駆細胞を標的として、先ず変異Venusを標的としたPEを行う。それに引き続き、治療標的遺伝子であるIL2RG遺伝子座のexon2を修復するprime editingを行う。