カルシウム恒常性障害に着目した先天性大脳白質形成不全症の新規細胞病態の解明

Research Project

Project/Area Number	22K07900
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research Institution	National Center of Neurology and Psychiatry
Principal Investigator	李コウ国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所疾病研究第二部, 科研費研究員 (70621994)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	大脳白質形成不全症 / 小胞体カルシウム枯渇 / ミトコンドリア機能障害 / カルシウム恒常性 / 小胞体 / ミトコンドリア / Pelizaeus-Merzbacher病
Outline of Research at the Start	Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)は髄鞘膜蛋白質PLP1の変異により中枢神経系の髄鞘形成不全を呈する先天性大脳白質形成不全症の代表的な疾患である。我々は、変異体PLPはオリゴデンドロサイト細胞の小胞体Ca2+枯渇及びミトコンドリア膜電位低下を誘導する現象から、新たな病態モデルとして、過剰な小胞体ストレスによって、小胞体のCa2+恒常性維持が破綻し、ミトコンドリア・小胞体接触部位(MAM)を介して小胞体からミトコンドリアに過剰なCa2+が流入して、ミトコンドリア機能の破綻が起こるという新規病態仮説を提唱し、このモデルの検証とその細胞分子機序の解明を行う。
Outline of Annual Research Achievements	Pelizaeus-Merzbacher病は先天性大脳白質形成不全の代表的な疾患である。従来、変異体の髄鞘膜蛋白質PLP1は、過剰な小胞体ストレスによって細胞に起こるunfolded protein response（UPR）によりoligodendrocytes (OLs)細胞死を誘導するものと考えられて来た。しかし、細胞死シグナル経路を抑制してもモデル動物の症状を改善できないことから、他の細胞病態の介在が示唆されている。最近我々は、変異体PLPはUPRとミトコンドリア膜電位低下を誘導する現象から、過剰な小胞体ストレスによって、小胞体のCa2+恒常性維持が破綻し、ミトコンドリア・小胞体接触部位(MAM)を介して小胞体からミトコンドリアに過剰なCa2+が流入して、ミトコンドリア機能の破綻が起こるという新規病態仮説を提唱し、このモデルの検証と細胞分子機序の解明を行う。本研究の計画は以下の3項目について、順次解析を進めていく。①変異体PLP1のOLsにおける小胞体Ca2+の恒常性障害の検証。②変異体PLP1による、ミトコンドリアの機能障害及びCa2+恒常性障害の検証。③小胞体に蓄積した変異体PLP1がMAMを介しミトコンドリアの機能障害を引き起こす分子メカニズムの解明。本年度は主に①について検証した。HeLa細胞、Oli-neu細胞に小胞体のCa2+インジケーター（G-CEPIAer）発現ベクターと変異体PLP1を共発現し、小胞体Ca2+動態シグナルを蛍光強度で評価した。更に、OLs特異的プロモーター下にG-CEPIAerを発現するAAVベクターを作成し、Msdマウスの脳に直接投与し、in vivoでOLsにおける小胞体Ca2+シグナルを検証した。その結果、変異体PLP1による細胞株及びマウスのOLsにおける小胞体のCa2+枯渇を引き起こすことを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は計画通り研究を順調に進んでいる。既に変異体PLP1による細胞小胞体のカルシウム枯渇を引き起こすことを確認した。
Strategy for Future Research Activity	今後は変異体PLP1によるミトコンドリアのCa2+恒常性障害及び機能障害の有無を検討する。ミトコンドリアにCa2+過剰流入があるかどうかを確認するため、HeLa細胞、Oli-neu細胞にミトコンドリアのCa2+インジケーター（G-CEPIAmt）発現ベクターと変異体PLP1を共発現し、オルガネラCa2+動態シグナルを蛍光強度で評価する。ミトコンドリアの機能障害を調べるため、変異体PLP1を発現するHeLa細胞及びOli-neu細胞を用いて、細胞外Flux Analyzerでミトコンドリアの好気呼吸機能と無酸素性解糖機能を解析する。