肝芽腫発生モデルを利用したエピゲノム異常がもたらす抗がん剤耐性機序の解明

Research Project

Project/Area Number	22K07907
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	本多昌平北海道大学, 大学病院, 講師 (90588089)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	北河徳彦地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 医長 (00585135) 鈴木拓札幌医科大学, 医学部, 教授 (20381254) 田中祐吉地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 医師 (50420691)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	肝芽腫 / エピゲノム解析 / シスプラチン耐性 / DNAメチル化異常 / miRNA発現異常
Outline of Research at the Start	肝芽腫は小児肝悪性腫瘍でゲノム変異数が少なく、DNAメチル化・miRNA発現異常によるエピゲノム異常が腫瘍の発生進展に大きく関わる。臨床課題として主要な治療薬であるシスプラチン(CDDP)耐性獲得が問題であるが、その原因となる分子機構異常は明らかでない。本研究では、肝芽腫発生モデルを模倣して、iPS細胞由来肝芽細胞に特異的シグナルパスウェイの遺伝子発現導入をおこない肝芽腫細胞を誘導する。CDDP耐性を獲得した肝芽腫細胞のエピゲノムプロファイリングにより、耐性獲得に関わるメチル化およびmiRNA発現異常を同定する。
Outline of Annual Research Achievements	【研究の目的】本研究では、肝芽腫発生モデルを模倣して、iPS細胞由来肝芽細胞に特異的シグナルパスウェイの遺伝子発現導入をおこない肝芽腫細胞を誘導する。CDDP耐性を獲得した肝芽腫細胞のエピゲノムプロファイリングにより、耐性獲得に関わるメチル化およびmiRNA発現異常を同定する。遺伝子異常の蓄積が少ない肝芽腫細胞・臨床検体を研究対象とすることで、エピゲノム異常が直接的に抗癌剤耐性獲得に働く機序を探求することが可能と考えられ、他癌種に共通するドライバーとしてのエピゲノム異常を解明し新規治療法開発につながると期待される。【研究の成果】 iPS細胞由来肝芽細胞より誘導した肝芽腫細胞のエピゲノム解析ヒトiPS細胞由来iCell Hepatoblast(FUJIFILM)の供給停止に伴い、iPS derived Definitive Endoderm(TAKARA bio)を用いてβcatenin活性型変異(βcateninS37Y)、YAP活性型変異(YAPS127A)をLentivirusを用いて導入し、その発現レベルをRT-PCRおよびWBにて確認した。βcateninのターゲット遺伝子であるAxin2, Areg、YAPのターゲット遺伝子であるCTGF, Cyr61についても有意な発現上昇を確認した。細胞形態の違いは明らかで、遺伝子変異の導入により表現型に変化が生じたことを示唆するものであった。エピゲノム編集に関わるDNMT3bはβcatenin・YAPの両者を導入した群で発現上昇を、TET1の発現は有意に低下を認めた。肝芽腫への誘導が得られた細胞を用いて現在RNA-seq解析をおこない、誘導した細胞特異的な遺伝子プロファイリングを施行中である。またChIP-seq解析をおこなっており、エピゲノム修飾のプロファイリングも同時進行して施行中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 実験開始当初はiPS細胞由来肝芽細胞の培養確立、および変異遺伝子導入のための基礎実験に時間を要したが、実験系が確立できてからは安定したin vitro解析の進行が可能となった。その矢先にiCell Hepatoblast(FUJIFILM)の供給停止に伴い、iPS derived Definitive Endoderm(TAKARA bio)を急遽採用し、各種遺伝子のmRNA発現解析を行った上で誘導した細胞(株）の特性を確認し、最終的には網羅的発現解析(RNA-seq解析)にて肝芽腫の特徴を有していること(GSEA解析）を検討した。当初の実験計画であるCDDP耐性獲得に関わる候補遺伝子の選別をおこなう工程にまでは至っておらず、いましばらく準備が必要な段階である。
Strategy for Future Research Activity	肝芽腫発生モデルを模倣した肝芽腫細胞の誘導を経た上で、CDDP耐性能獲得にはたらくmolecular mechanismを探求し、CDDP耐性候補遺伝子の選別を進める。 validationに用いる臨床検体サンプルは既に準備ができており、パイロシークエンサーによるメチル化解析をおこなう環境設定もおこなえているため、CDDP耐性解除に働く遺伝子同定まで進めていけると考えている。