小児腸管内の病原・薬剤耐性遺伝子水平伝播におけるAtypical EAECの役割

Research Project

Project/Area Number	22K07919
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	藺牟田直子鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (00643470)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	西順一郎鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (40295241) 大岡唯祐鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (50363594)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Keywords	EAEC / atypical EAEC / aggR / biofilm / HEp-2 assay / ESBL / CTX-M
Outline of Research at the Start	腸管凝集性大腸菌（Enteroaggregative Escherichia coli, EAEC）は、わが国の小児由来下痢症大腸菌で最も多く検出されるが、臨床現場での認識は十分ではない。EAECは、転写調節因子AggR reguronを持つtypical EAEC（tEAEC) と持たないatypical EAEC（aEAEC) に分けられ、我々はtEAECの薬剤耐性・病原遺伝子獲得を明らかにした。近年aEAECによる集団食中毒事例増加により、その分子疫学解析と病原性の解明が求められる。本研究は、tEAECの研究をもとに薬剤耐性・病原遺伝子水平伝播におけるaEAECの役割の解明を目的とする。
Outline of Annual Research Achievements	2022年度は、2011～19年の小児下痢症患者の便由来大腸菌3291株から143株のatypical EAEC (aEAEC)を決定し、病原遺伝子、基質特異性拡張型β-ラクタマーゼCTX-M遺伝子の検出、CTX-M型別を行った。まず3291株からaggR遺伝子保有EAEC（typical EAEC, tEAEC）81株とその他の下痢原性大腸菌の病原遺伝子を保有する株を除いた3099株を対象に、バイオフィルムアッセイでバイオフィルム形成能（BI）の高い株（＞OD0.2 ）193株を抽出し、HEp-2細胞付着試験でaEAEC 143株を決定した。 aEAEC143株中19株（13.3％）が典型的な凝集付着（tAA）を示し、124株（86.7％）は非典型的な凝集付着（aAA）を示した。BIはtAA 0.75、aAA 0.4とtAAの方が高い値を示した。CTX-M遺伝子は9株（6.3％）が保有し、そのうち6株（66.7％）はaAAで、CTX-M型は14が3株、15が3株、27が2株、97が１株であった。K1莢膜遺伝子は33株（23.1％）が保有し、そのうち32株（97％）がaAAであった。PhylogroupはB2が69株（48.3％）と最も多く、68株（98.6％）がaAAであった。tEAECのプラスミドと染色体上の病原遺伝子保有株が49株（34.3％）、phylogroup A・B1・B2に属する多くの株がその両方の病原遺伝子を同時に保有していた。尿路病原性大腸菌の病原遺伝子はphylogroup EとUT(untypable)以外の株で検出された。CTX-M/K1遺伝子保有株がCTX-M型14と15の2株検出されたが、14の株はphylogroup B1に属しEAECの染色体とプラスミドの両方の病原遺伝子を保有し、付着はtAAを示した。 tEAEC 81株についてもHEp-2細胞付着試験を行い、tAA 28株（34.6％）、aAA 24株（29.6％）がみられたが、29株（35.8％）はBIが0.2以下で凝集付着を示さない株であった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は、2011年～2019年に鹿児島県で収集した3291株の小児下痢症患児由来大腸菌からEAECの特徴であるバイオフィルム形成能によるスクリーニング後、HEp-2細胞付着試験を行い、細胞への凝集と付着の様式によってaggRを保有しないaEAECを143株検出することができた。さらに今回検出されたaEAECの病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子の検出を行ったことで、aEAECの付着様式の多様性、付着様式による病原遺伝子の保有状況の違いが明らかになった。また、aEAECの中にもtEAECの染色体上の遺伝子やプラスミドを保有する株やCTX-M/K1遺伝子保有株が存在することが明らかになった。aEAECの病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子の保有状況が明らかになったことは課題の遂行にたいへん有意義であった。さらにtEAECの約36％は凝集付着を示さず、BIも低い値であるということが新たに明らかになった。
Strategy for Future Research Activity	今回、EAEC（tEAECとaEAEC）の細胞への凝集付着やバイオフィルム形成能には大きな多様性があり、他の病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子を獲得している株が多くあることが分かった。これまでEAECの既知の線毛を持つaEAECは報告されていなかったが、今回の研究で新たにaEAECの中にもEAECの既知の線毛を保有する株があることが分かった。今後はその由来を検討する予定である。また、線毛が不明の株でも強い付着を示す株があったことから未知の線毛の存在が示唆され、今後新たな線毛の探索を行う予定である。EAECの定義は、HEp-2細胞付着試験での細胞とガラス面への凝集付着であるが、aEAECを含めた広義のEAECを簡便に検出するためにaggR遺伝子以外の検出マーカーの探索が必要とされる。そのためにまずaEAECとtEAEC両方についてMLSA（multilocus sequence analysis）などの系統解析を実施する予定である。一方、EAECは多くの外来性に病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子を獲得している株が多いことから、遺伝子の伝達試験を行うことによって凝集付着やバイオフィルム形成能と病原・薬剤耐性遺伝子水平伝播の関係を検討する予定である。