新規ウイルス探索を含めた川崎病患者に対するショットガンメタゲノム解析

• Project/Area Number: 22K07944
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 鈴木 寿人 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (80783042)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000); Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: 川崎病 / メタゲノム / ウイルス / 感染症

Outline of Research at the Start

川崎病は小児期に発症する原因不明の発熱疾患であり、一部の患者に後遺症として重篤な冠動脈疾患が問題となっている。地域流行例・家族内発症例を認め、病原体の関与が示唆されるが、特定に至っていない。本研究では、事前の仮説なく、ショットガンメタゲノム解析により病原体を特定する。
川崎病診断基準を満たす患者100名（4名リクルート済み）の各種体液由来DNA/RNAのショットガンシーケンシングを行う。得られた配列断片を再構築し、NCBIデータベース全病原体配列と比較し、各検体において最も近似する病原体を抽出する。

Outline of Annual Research Achievements

川崎病は小児期発症の原因不明炎症性疾患であり、地域流行例や家族内発症例を認め、なんらかの病原体の関与が示唆されている。本研究では、患者の咽頭ぬぐい液から抽出したDNA／RNAを用いてショットガンメタゲノム解析を実施し、病原体を特定することを目的とした。
2022年度の計画では、検体の収取、DNA抽出手法の確立、メタゲノムシーケンスの生データの取得とパイプラインの最適化が研究実施計画として立案していた。検体は協力病院より30件以上の検体を集めることができた。健常者の咽頭ぬぐい液をコントロールとして用いてDNA抽出を試み、インキュベートの時間、温度管理、細胞破砕時の遠心時間管理などの調整を行った。30検体分の咽頭ぬぐい液からのDNA抽出を実施し、メタゲノムシーケンスを行った。得られたメタゲノムシーケンスの生データから、一部の検体から抽出したDNAは量あるいは質が不十分ではなく、得られたデータ量が解析に必要な量よりも少なく、それらのデータについては、除外した。
感染性微生物のプロファイリングでは、データ量が十分のものに対して、細菌叢、真菌、ウイルスに対してKlerkenを用いた解析を実施することができ、今後は検体の集積をまって罹患者に共通する感染性微生物の推定などを実施する方針としている。
研究全体としては概ね順調に進捗していると考えられ、来年度以降は引き続き検体収集を行う。DNA抽出量が不十分だった原因としては、咽頭ぬぐい液に付着した分泌物量などに依存している可能性もあり、手技についての見直しなどを行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

目標として100検体の収集を3年間の研究期間中を推定しており、1年間で30を超える検体収集をすることができている。メタゲノムシーケンスの生データの取得もできており、概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

引き続き２年間は検体収集を継続する。
DNA抽出については、不安定な部分もあるが綿棒についているぬぐい液の濃度に依存するものであることも推定されるため、収集手技についても統一化を図っていく。