食道扁平上皮癌がん幹細胞における免疫逃避機構の解明

• Project/Area Number: 22K08000
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 夏井坂 光輝 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (80642446)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須田 剛生 北海道大学, 医学研究院, 講師 (20447460) ; 前原 経 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (80836338)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 癌幹細胞 / 食道扁平上皮癌 / 免疫チェックポイント阻害剤

Outline of Research at the Start

食道扁平上皮癌CD24low/CD44high癌幹細胞においてPD-L1、PD-L2の発現が有意に上昇しており（unpublished data）、非癌幹細胞に比して癌幹細胞において免疫チェックポイント阻害剤の効果が異なることが示唆されている。本研究はESCC癌幹細胞における免疫チェックポイント阻害剤の効果を3次元培養、オーガノイド、マウス発癌モデルを用いて詳細に検証する。さらに、免疫チェックポイント阻害剤とFGFR/Erk経路阻害剤の併用療法の可能性をマウス発癌モデルを用いて検証する。本研究によりESCC癌幹細胞を標的とした新たな治療戦略の構築が期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本邦においても食道扁平上皮癌（ESCC）に対して免疫チェックポイント阻害剤が臨床の現場で使用可能となった。我々はこれまでの豊富なESCCに関する実験データ（DNAマイクロアレイ）、ESCC癌幹細胞のサンプルを用いて解析を行ったところ、CD24low/CD44high癌幹細胞においてPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加していることを確認した。さらに、FGFR/Erk経路阻害剤（trametinib）により一部のCD24low/CD44high癌幹細胞は減少し、殺細胞性の抗癌剤に対する治療抵抗性は回復するが、残存したCD24low/CD44high癌幹細胞ではPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加していた。FGFR/Erk経路阻害剤であるtrametinibと抗PD-1抗体の併用療法がESCC癌幹細胞を標的とした有効な新規治療法となり得る可能性が期待される。
本研究はESCC癌幹細胞におけるPD-L1、PD-L2の発現調節機構の解明、免疫チェックポイント阻害剤の効果を3次元培養、オーガノイド、マウス発癌モデルを用いて詳細に検証することを目的に遂行される。さらに、免疫チェックポイント阻害剤とFGFR/Erk経路阻害剤の併用療法の可能性をマウス発癌モデルにより検証する
令和5年度は以下の新たな知見が得られた。ESCC細胞株をTGF-β1、FGF2で処理すると再現性を持ってPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加した。同実験系を用いてRNAシーケンスによる網羅的解析を行い、TCGAデータ及びChipシーケンスデータとの複合解析を行った。転写因子SRGN、SHISAL1、ETS1、FOSL1、HEY1がESCC癌幹細胞におけるPD-L1発現調節において重要な役割を担っている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

動物実験（食道扁平上皮癌発癌マウスモデル）において予想された腫瘍が得られなかったため、やや遅れていると判断した。
本研究の現在までの進捗により、ESCCのCD24low/CD44high癌幹細胞においてPD-L1の発現が有意に増加していることは複数の細胞株、実験系において再現性を持って確認されている。更にESCCのCD24low/CD44high癌幹細胞におけるPD-L1の発現調節において重要な役割を担う可能性のある転写因子の候補が複数個同定された。本研究によりESCC癌幹細胞を標的とした新規治療法の開発が期待される。

Strategy for Future Research Activity

CD24low/CD44high癌幹細胞のPD-L1発現調節における転写因子SRGN、SHISAL1、ETS1、FOSL1、HEY1の機能解析を進める。各転写因子の発現抑制系を作成し、PD-L1の発現量を解析する。逆にCD24high/CD44lowのESCC癌細胞において過剰発現系を作成し、PD-L1の発現量を解析する。
動物実験（食道癌発癌モデル）で当初予想されていた腫瘍が認められなかったため、実験条件を変更する。C57BL/6マウスの週齢数を4週齢にし、4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) 100mg/L、2%プロピレングリコール飲用水の投与期間を20週間に延長する。その後、通常の飲用水に戻し、8週後に屠殺する。形成された食道腫瘍を摘出し、免疫染色（PD-L1、PD-L2、CD44、CD24、扁平分化マーカー、EMTマーカー、免疫細胞マーカー）を行う。
動物実験全体の進捗状況が遅れているため治療実験は、①コントロール、②trametinib、③マウス抗PD-1抗体 、④マウス抗PD-1抗体 + trametinibの4アームに減らして行う。