ゲノム編集による非アルコール性脂肪肝炎の新規治療法開発

• Project/Area Number: 22K08013
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 今村 道雄 広島大学, 病院(医), 講師 (40403513)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 非アルコール性脂肪肝炎 / PNPLA3 / 遺伝子編集 / ゲノム編集

Outline of Research at the Start

リスクアレルを有するPNPLA3あるいはTM6SF2遺伝子のヒト肝細胞を移植マウスにフルクトース含有高コレステロール食を給餌させ、ヒトNASHに極めて類似したモデルを作成する。NASHモデルマウスにアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにCas9システムを挿入したAAV-Cas9を経静脈的に投与し、肝細胞内にPNPLA3あるいはTM6SF2遺伝子を標的としたgRNAを発現させ、これら遺伝子を非リスクアレルにゲノム編集することで、NASH病態の改善を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

非アルコール性脂肪肝炎（NASH）患者の疾患進行に関係する一塩基多型（SNP）であるPNPLA3-I148M変異は、疫学研究において肝臓の脂肪化や線維化、HCCのリスクを上昇させることが報告されている。マウスモデルで肝脂肪および線維化についての報告があるが、ヒト肝細胞ではこのような実験データは示されていないため、遺伝子編集を用いて病態モデルを確立することを試みた。従来のCRISPR-CAS9システムではオフターゲットの影響が強く、In-delを生じる可能性があるが、Prime editingはDNAおよびRNAでのオフターゲット効果の低下が期待できるため、これを用いてPNPLA3 rs738409の遺伝子編集を試みることとした。Prime Editor プロトスペーサ標的の選定を行い、rs738409編集用Prime Editingベクター（pegRNA/epegRNA/ngRNA）を作製した。これらのシステムとPE5を組み込み、GFPをP2A配列で結合させたオールインワンプラスミドを開発した。Poly-L-Lysineコートした96well plateにHEK293T細胞を15000/well撒き、同日90 ng/wellのLipofectamin LTXを用いてtransfectionさせた。72時間後に蛍光顕微鏡でGFPが発現し、transfection成功が期待される細胞が存在していることを確認した。トリプシンで細胞を剥がし、DNeasy Blood & Tissue Kit でDNAを抽出した。PCRで増幅し、ゲル精製後BigDye Terminator v3.1を用いてseq PCRを行った。ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzerでシークエンスを確認すると、標的部位に43％のC to Gの編集が起こっていた。