| Project/Area Number |
22K08019
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
大宮 直木 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00335035)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 歩 愛知県がんセンター(研究所), 分子診断TR分野, 分野長 (50817567)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | クローン病 / 小腸病変 / プロテオーム解析 / バイオマーカー / 小腸 |
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| Outline of Research at the Start |
クローン病は日本では年間5万人近くが罹患し、増加の一途を辿っている原因不明の肉芽腫性炎症性腸疾患で、厚生労働省指定難病になっている。特に、小腸病変単独の小腸クローン病では初期は症状に乏しく、狭窄が高度になってから診断されることが多い。小腸病変の画像診断法にはCT、MRI、小腸造影、内視鏡があるが、スクリーニング検査の位置付けではない。便中カルプロテクチンは鋭敏な炎症マーカーであるが、採便が困難な場合や便の持参に抵抗感がある。血液のバイオマーカーは特異性に乏しく偽陰性も多い。そこで、本課題ではクローン病小腸病変の存在および疾患活動性を予測する世界発の新たな血液バイオマーカーの探索を目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題ではクローン病小腸病変の存在および疾患活動性を予測する新たな血液バイオマーカーの探索を目的とし、同一患者で内視鏡的に小腸病変が活動期の血漿と、その後治療強化により内視鏡的に粘膜治癒した半年後の血漿をプロテオーム解析で比較して候補物質を探り、かつ内視鏡時に小腸の生検サンプルを採取し、候補物質のmRNA発現、抗体による蛋白発現を調べる。2022年度はクローン病患者に対するダブルバルーン小腸内視鏡の施行とその直前の血液検体・便検体・内視鏡時の粘膜生検検体の採取およびプロテオーム解析の試薬購入と準備を行った。
具体的には83人のクローン病の血液検体を採取し、そのうち20人はダブルバルーン小腸内視鏡を6ヶ月の間隔で2回施行し、ペア血液検体、便検体、粘膜生検検体を採取した。検体採取日には疾患活動性評価指標であるCDAIの算出および内視鏡的治療効果判定にはSimple endoscopic score for Crohn’s disease(SES-CD)を用いた。採血は通常のCBC、生化学検査に加え、炎症マーカーである高感度CRP、赤血球沈降速度、ロイシンリッチα2グリコプロテイン (LRG)、血清アミロイドAも調べている。他疾患コントロールとして、潰瘍性大腸炎患者96人、消化管腫瘍46人の血液検体採取を行った。健常者コントロールとしては上部消化管内視鏡、大腸内視鏡、採血、便検査で異常を認めない13人の血液検体を保管している。
質量分析関連の試薬としてはリシルエンドペプチダーゼ、質量分析グレード、TMT10plex Isobaric Label Reagentを購入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画年度1年目は治療前後のペア検体の採取が主な研究内容であるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．プロテオーム解析：活動期の血漿（20サンプル）、治療強化半年後の血漿（20サンプル）、および年齢・性別をマッチさせた健常者の血漿（20サンプル）をドライシッパーで搬送する。2種類の治療（抗TNF-α抗体製剤、抗IL-12/23p40抗体製剤）の有効例、無効例、治療強化前後に採取された血漿を各々等量配合する（2種類[治療]×2通り[有効・無効]×2通り[治療強化前後]の8種類に分けて1種類の5例分を等量配合）。各血漿からProtein A/G Beadsを用いて免疫グロブリン複合体（抗原-自己抗体複合体）を回収し、さらにアルブミンなどの高含有蛋白を除去する。トリプシン消化後、定量ラベル試薬を反応させる。免疫グロブリンに結合した抗原蛋白を同定し、自己抗体プロファイルを得る。免疫グロブリン抗体固相カラムの溶出pH条件の最適化とSDS-PAGEによる免疫グロブリン除去によるペプチド分画システムによる大規模分画による定量的質量分析法を行う。２．候補物質の確認：バイオマーカー候補の蛋白、自己抗体については、ELISA、プロテインアレイを用いた検出アッセイを確立し、血液検体での検出を確認する。抗体が入手できない場合はマススペクトロメトリーを用いた多重反応モニタリングによる定量アッセイ法の開発を検討する。組織検体ではmRNA発現はRT-PCR・パラフィン切片でのin situ hybridization、蛋白発現はパラフィン切片での免疫組織化学染色で確認する。
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