| Project/Area Number |
22K08062
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
|
|---|
| Research Institution | Tokai University |
|---|
Principal Investigator |
加川 建弘 東海大学, 医学部, 教授 (30245469)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
紙谷 聡英 東海大学, 医学部, 准教授 (30321904)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
|
|---|
| Keywords | 胆汁うっ滞 / 胆汁酸 / 進行性家族性肝内胆汁うっ滞症 / ノックアウトマウス / ゲノム編集 / モデル動物 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC）は小児期に肝不全となり、肝移植を必要とする進行性かつ重篤な疾患である。６つの型があり、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、NR1H4、MYO5Bの遺伝子異常で発症する。PFICはモデル動物がなく、発症機序の解明や治療薬の開発は進んでいない。本研究ではヒト型胆汁酸マウスを用いて、ゲノム編集技術でPFIC原因遺伝子をノックアウトしたトリプルノックアウトマウスを作製し、PFIC発症機序の解明、治療薬開発のための基盤とする。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis、PFIC）は小児期に肝不全となり、肝移植を必要とする進行性かつ重篤な疾患である。従来から、血清γ-GTPが上昇しないPFIC1、PFIC2とγ-GTPが上昇するPFIC3の３型が知られていた。PFIC1はphosphatidylserine flippaseであるATP8B1、PFIC2は胆汁酸トランスポーターであるABCB11、PFIC3はphosphatidylcholineトランスポーターであるABCB4の遺伝子異常で発症する。PFIC1,2,3に加えて、TJP2、NR1H4、MYO5Bの遺伝子異常で肝内胆汁うっ滞が発症することが報告されており、それぞれPFIC4, 5, 6と呼ばれている。PFICは重篤な疾患であるにも関わらず、発症機序の解明や治療薬の開発は進んでいない。その最大の原因はモデル動物の欠如である。マウスやラットの胆汁酸はミュリコール酸など親水性の胆汁酸が多く、細胞障害性が少ないため、PFICの原因遺伝子をノックアウトしても、肝障害を生じない。本研究ではミュリコール酸合成に関与する2つの酵素をダブルノックアウトしたヒト型胆汁酸マウスを用いて、さらにゲノム編集技術を用いてPFIC原因遺伝子をノックアウトしたトリプルノックアウトマウスを作製した。2023年度はABCB4, NR1H4ノックアウトし、その表現型を詳細に解析した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ABCB4、NR1H4遺伝子のエクソンのコーディング領域を標的とするgRNAを設計した。設計したgRNAとSaCas9タンパク質が肝特異的プロモーター制御下に発現するAAVベクターを作製した。これらのAAVをヒト型胆汁酸マウスの腹腔にinjectionし、目的の蛋白の発現が肝臓で欠損していることを確認した。ABCB4ノックアウトマウスでは顕著な肝障害が出現し、肝組織では門脈域に著明な炎症性細胞浸潤と線維化、ならびに細胆管反応が認められた。肝のmRNA解析では炎症マーカーであるTnfα、Il1βの増加、線維化マーカーであるCol1a1の増加、ならびにCyp8b1の著減を認めた。肝における胆汁酸分析ではタウロケノデオキシコール酸の増加を認め、肝障害との関連が示唆された。NR1H4ノックアウトマウスでは中途度の肝障害が見られた。肝のmRNA解析では炎症マーカーであるTnfα、Il1βの増加、線維化マーカーであるCol1a1の増加のほか、脂質代謝、糖代謝に関与する多くの遺伝子に変動が見られ、詳細を解析中である。また、ABCB11ノックアウトマウスでは肝障害は軽度であった。ヒトとマウスの表現型が異なる原因につき、検討している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和５年度に作成したABCB4ノックアウトマウスについては、論文投稿中である。NR1H4ノックアウトマウスについては肝障害の原因につき、さらなる解析が必要であり、NR1H4肝特異的ノックアウト、全身ノックアウトによる肝障害の相違などにつき、検討するとともに、治療薬の開発についても検討を加える。また、残りのPFIC原因遺伝子についても順次AAVベクターを用いたゲノム編集によりノックアウトマウスを作製し、表現型を解析していく予定である。
|
