Examination of the effect of combination therapy of galectin-9 and epigallocatechin gallate on hepatocellular carcinoma

Research Project

Project/Area Number	22K08078
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 53010:Gastroenterology-related
Research Institution	Kagawa University
Principal Investigator	正木勉香川大学, 医学部, 客員研究員 (30335848)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小原英幹香川大学, 医学部附属病院, 講師 (10612476) 岩間久和香川大学, 医学部, 准教授 (20398035) 仁木敏朗香川大学, 医学部, 助教 (40558508) 田所智子香川大学, 医学部附属病院, 助教 (50813177) 森下朝洋香川大学, 医学部附属病院, 講師 (60423430) 大浦杏子香川大学, 医学部附属病院, 助教 (80834639) 谷丈二香川大学, 医学部, 助教 (00596075) 中原麻衣香川大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00865610) 藤田浩二香川大学, 医学部附属病院, 助教 (50749421)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	エピガロカテキンガレート / 耐性癌細胞 / micro RNA / 抗がん作用 / 肝細胞癌 / 分子標的治療薬 / 耐性株 / ガレクチン-9 / microRNA
Outline of Research at the Start	最近エピガロカテキンガレート(EGCG)は細胞増殖抑制機構を介して副作用の少ない患者の優しい補助的癌治療薬なりうる可能性が報告されつつある。(molecules 23:2284,2018)。肝細胞癌(分子標的治療薬耐性となった癌細胞も含めて)に対するアポトーシスの誘導により癌抑制効果を持つGa1-9と細胞周期G1アレスト効果を持つEGCGの併用療法が肝細胞癌に対しGa1-9単独と比較しより強い治療効果があるかどうかを検証する。さらにその併用療法の癌抑制機構のメカンズムと腫瘍内のmicroRNAが変化することにより抗腫瘍活性を持つ可能性についての基礎的検討をする。
Outline of Annual Research Achievements	緑茶に含まれるエピガロカテキンガレート（以下：EGCG）は疫学的に癌の発生予防効果が報告されており、ある種の癌細胞の抑制効果も報告されている。しかしながら肝癌の分子標的治療薬Lenvatinib、Sorafenib耐性癌細胞株に対するEGCGの効果は明らかではない。そのような耐性癌細胞を含む肝癌細胞株におけるEGCG の抗腫瘍効果について基礎的解析をした。【方法】（１）昨年度Hep3Bを用いて培養液中にLenvatinib、Sorafenibの耐性株を樹立させIC５０値を決定した。（２）Hep 3BのWild type, 耐性株におけるEGCGの細胞増殖抑制効果をMTT assayで解析した。（３）Lenvatinib、Sorafenib耐性肝癌細胞株Hep3Bをヌードマウスの皮下に移植し、EGCGを腹腔内に投与し、抗腫瘍効果を検討した。（３）Lenvatinib、Sorafenib耐性肝癌細胞株Hep3B をヌードマウスの皮下に移植し、EGCGとガレクチン９をEGCGに腹腔内に投与し、抗腫瘍効果を検討した。（４）Lenvatinib、Sorafenib耐性肝癌細胞株Hep3BにEGCGの抗腫瘍作用効果に関連するmicroRNAを網羅的に解析した。。【成績】Hep3BのWild 細胞株、Lenvatinib、Sorafenibの耐性株においてEGCGの濃度依存的に細胞増殖抑制効果を示した。しかしながらガレクチン９の相乗効果は認められなかった。また、EGCG投与前後にHep3BのmicroRNAは明瞭なクラスターを形成し、EGCG投与により抗腫瘍効果に関連するmicroRNA分子を見出だした。その分子は、miR-RNA7151、miR--8063, miR-4665, miR--575, miR5787, miR-6131であった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 理由この一年で、予定以上の研究成果を出すことができた。今は、得られた結果の部分EGCGにおける、肝癌細胞株の抑制を論文にまとめていく段階になっている。 2種類の肝癌細胞株HuH-7、Hep3Bを用いて培養液中にLenvatinib、Sorafenibの耐性株を作成できた。耐性株におけるEGCGの細胞増殖抑制効果をin vitro, in vivoで解析したところ、Hh7には、癌抑制効果見られなかったが、Hep3Bには、癌細胞抑制効果が見られた。また、EGCG投与前後にHep3BのmicroRNAは明瞭なクラスターを形成し、EGCG投与により抗腫瘍効果に関連するmicroRNA分子を見いだした。その分子は、miR-RNA7151、miR--8063, miR-4665, miR--575, miR5787, miR-6131であった。また、ガレクチン―9との相乗効果が認められなかったが、現在ガレクチン9を抗腫瘍剤シスプラチンに変更して、研究を進めている。ほぼ、予定より、早く進行している。
Strategy for Future Research Activity	まずはチップからHep3BのWild 細胞株、Lenvatinib、Sorafenibの耐性株においてEGCGの濃度依存的に細胞増殖抑制効果に関連する分子を見出した。これを別の方法で確認する。その分子は、miR-RNA7151、miR--8063, miR-4665, miR--575, miR5787, miR-6131であった。これらの分子が正しいことをReal time PCRで確認する。またこれら分子がEGCGでの添加によってチップで増量したことをReal time PCRで確認する。次に確認されたmicroRNAをin vivoの系でHep3BのWild 細胞株、Lenvatinib、Sorafenib耐性株のヌードマウスに移植した腫瘍の周りに注入し、EGCGと同様に抗腫瘍効果を示すかどうかを確認する。もし確認できれば、肝細胞癌に対する新しい抗腫瘍効果を持つmicroRNA となる。