CXCR7の動脈硬化における機能解明とPETによる臨床応用に向けて

• Project/Area Number: 22K08154
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53020:Cardiology-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 馬場 理 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (30758446)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 動脈硬化 / 非定型ケモカイン受容体 / CXCR7 / PET

Outline of Research at the Start

非定型的ケモカイン受容体CXCR7は動脈硬化進展において重要な機能を持つと考えられるが、その動脈硬化巣における発現分布を含めて判明していないことが多い。一方、PET検査は生体内での分子動態を非侵襲的に評価できる点で、近年、動脈硬化性疾患領域でも注目を浴びている。本研究では、マウスモデルを用いた動脈硬化巣におけるCXCR7の発現および機能解析、および臨床応用に向けたCXCR7特異的PETトレーサーの開発およびマウスモデルでの動脈硬化巣におけるPETシグナル解析を行う。これらが達成されることによって、動脈硬化性疾患における新たな診断モダリティの創出が期待される。

Outline of Annual Research Achievements

ヒトにおいてケモカインの一つであるCXCL12の血中での上昇は動脈硬化性疾患のリスク因子である。一方、申請者らは、その主要な受容体の一つであるケモカイン受容体CXCR4が逆に動脈硬化抑制的に働くことを以前に報告した。非定型的ケモカイン受容体CXCR7はCXCL12のもう一つの主要な受容体であり、上記の矛盾点を解明するための新たな鍵となることが期待されるが、その動脈硬化巣における発現分布を含めて判明していないことが多い。一方、動脈硬化性疾患において、動脈硬化巣における分子動態を非侵襲的に評価する方法の開発が求められているが、PET検査は潜在的にそれらを可能とする。本研究の目的は、マウス動脈硬化モデルを用いて動脈硬化巣中のCXCR7の発現細胞およびCXCR7の動脈硬化形成における機能を明らかにすることである。具体的には、1. マウスモデルを用いた動脈硬化巣におけるCXCR7の発現および機能解析、2. 臨床応用に向けたCXCR7特異的PETトレーサーの開発およびマウスモデルでの動脈硬化巣におけるPETシグナル解析を行う。これまでに、(1) CXCR7が動脈硬化巣中の内皮細胞に高発現していること、(2) 蛍光標識したCXCR7特異的ペプチド(Cy5-LIH383)が動脈硬化巣における内皮細胞に集積していることが判明していた。今回、それらに加えて(1) CXCR7が動脈硬化巣中の白血球分画には発現していないが血管平滑筋細胞にも発現していることが判明し、また、(2) CXCR7特異的ペプチドLIH383を用いたPETトレーサーの作成に成功した（64Cu-DOTA-LIH383）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初、当該年度の計画として予定されていた血管内皮細胞特異的CXCR7欠損マウス（CXCR7fl/fl VE-Cadherin CreERT2 Apoe-/- マウス）の作成には予定より時間がかかったものの、最終的に成功した。現在、ウェスタンダイエット負荷による動脈硬化巣形成実験を行っており、今後プラークサイズなどについて解析を行っていく予定である。また、ヒト動脈硬化巣においても免疫染色によって、マウスと同様にCXCR7は血管内皮細胞に高発現していることが判明した。そして、フローサイトメトリー解析および免疫染色によって、動脈硬化巣においては血管内皮細胞に加えて血管平滑筋細胞もCXCR7が発現していることが判明したため、今後、血管平滑筋特異的CXCR7欠損マウス（CXCR7fl/fl Sm22aCre Apoe-/- マウス）を作成予定である。しかしながら、蛍光標識したCXCR7特異的ペプチド(Cy5-LIH383)の動脈硬化巣における分布をフローサイトメトリーにおいて解析したところ、主に血管内皮細胞に結合しており、血管平滑筋細胞への結合は乏しいことが判明した。これは、投与したペプチドの大部分が動脈硬化巣表面にあるCXCR7に結合してしまい、内部に到達していない可能性が考えられた。そして、前述の如く、共同研究者であるWashington UniversityのYongjian Liu博士は、LIH383を用いて、CXCR7特異的PETトレーサー（64Cu-DOTA-LIH383）の開発に成功した。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通り、血管内皮細胞特異的CXCR7欠損マウス（CXCR7fl/fl VE-Cadherin CreERT2 Apoe-/- マウス）を用いて、CXCR7の動脈硬化形成に与える影響について解析を行っていく。具体的には、1週間のタモキシフェン投与によって内皮細胞でのCXCR7を欠損させる。その後、高脂肪食であるウェスタンダイエットを12週間投与して動脈硬化形成を促し、動脈硬化の解析を行う。大動脈根部および胸部大動脈でのOil Red O染色を用いた動脈硬化巣のサイズ評価、CD68染色を用いた動脈硬化巣におけるマクロファージ含有量の評価、そして末梢血中の単球を蛍光ビーズによって標識することによる動脈硬化巣への単球の取り込み量の評価を行う。また、血管内皮細胞におけるCXCR7の機能についてin vitroで解析するためにヒト血管内皮細胞株であるEA.hy926細胞においてCRISPR-Cas9システムを用いてCXCR7欠損安定細胞株を作成中である。今後、リガンドであるCXCL12に対する反応についてRNA-seq解析を行い分析していく予定である。そして、前述の如く、血管平滑筋にもCXCR7の発現を認めたために、血管平滑筋特異的CXCR7欠損マウス（CXCR7fl/fl Sm22aCre Apoe-/- マウス）についても作成を行い、同様に解析を行う予定である。また、開発したCXCR7特異的PETトレーサー（64Cu-DOTA-LIH383）の動脈硬化巣におけるPETシグナルについても解析を行っていく予定である。同時に、動脈硬化巣のサイズや単球の取り込み量、マクロファージ含有量を評価し、PETシグナルとの相関性を確認する。また、トレーサーのヒト動脈硬化サンプルへの集積を、Autoradiography解析によって評価する。